På grund av dess mångsidiga tillämpning som modellart inom olika studieområden finns det ett behov av en verktygslåda för genetisk transformation i smalbladig groblad (Plantago lanceolata). Här presenteras med hjälp av Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation ett protokoll som resulterar i stabila transgena linjer med en transformationseffektivitet på 20%.
Arter i släktet Plantago har flera unika egenskaper som har lett till att de har anpassats som modellväxter inom olika studier. Bristen på ett genetiskt manipulationssystem förhindrar emellertid en djupgående undersökning av genfunktionen, vilket begränsar mångsidigheten hos detta släkt som modell. Här presenteras ett transformationsprotokoll för Plantago lanceolata, den vanligast studerade Plantago-arten. Med hjälp av Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation, 3 veckor gamla rötter av aseptiskt odlade P. lanceolata växter infekterades med bakterier, inkuberas i 2-3 dagar, och sedan överfördes till ett skott induktion medium med lämpligt antibiotikum urval. Skott kom vanligtvis ut från mediet efter 1 månad, och rötter utvecklades 1-4 veckor efter att skotten överfördes till rotinduktionsmediet. Växterna acklimatiserades sedan till en markmiljö och testades för närvaron av en transgen med hjälp av β-glukuronidas (GUS) reporteranalys. Transformationseffektiviteten för den nuvarande metoden är ~ 20%, med två transgena växter som växer fram per 10 rotvävnader som omvandlas. Upprättandet av ett omvandlingsprotokoll för smalbladiga groblad kommer att underlätta antagandet av denna växt som en ny modellart i olika områden.
Konceptet att använda modellarter för att undersöka flera aspekter av växtbiologi uppstod med den utbredda användningen av Arabidopsis thaliana1. Arabidopsis valdes ursprungligen eftersom den delar funktioner med många andra blommande växter och har flera egenskaper som gör det bekvämt att studera i laboratoriemiljö, som att vara liten och ha en kort generationscykel. Den stora volymen forskningsartiklar publicerade med den som ämne, tillsammans med dess lilla genomstorlek och lätthet av genetisk omvandling2, gör det möjligt att fortsätta som en allmänt använd experimentell organism. Arabidopsis kan dock begränsas som modell för arter med olika egenskaper eller unika egenskaper3. Detta har lett till utvecklingen av nya modellsystem, såsom majs (Zea mays), en viktig växt för utvecklingsgenetik i monocots4, och tomat (Solanum lycopersicum), som är en viktig modell för evolutionära studier, fruktutveckling och produktion, och är en bra representation för vegetabiliska grödor5. En metod för genetisk omvandling är en förutsättning för att en växtart ska fungera som modellorganism2. En Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation är ett pålitligt verktyg inom växtbiologi; Det har använts för att omvandla några modellarter och större grödor, inklusive tobak (Nicotiana tabacum)6, ris (Oryza sativa)7, bomull (Gossypium hirsutum)8, sojabönor (Glycine max)9, potatis (Solanum tuberosum)10 och raps (Brassica napus)11. Växtarter är mycket varierande i hur framgångsrikt de svarar på A. tumefaciens infektion, och transformationsprotokoll måste ofta skräddarsys individuellt för varje art 6,12.
Släktet Plantago innehåller totalt 256 växtarter, utbredda över hela världen13. Arterna i detta släkte har ofta unika egenskaper som gör dem önskvärda som modellarter för att studera genetik, ekologi, stressfysiologi, sekundära metaboliter, läkemedelskemi, växt-mikrobinteraktioner, växtutveckling och evolution. Plantago lanceolata , även kallad narrowleaf eller ribwort plantain, har varit en populär växt av intresse sedan19-talet , då den först användes för att beskriva fenomenet manlig sterilitet14. Liksom andra växter i sitt släkte har den använts i studier inom olika forskningsområden. På senare tid har det föreslagits som en modell för vaskulär biologi, eftersom dess vaskulära vävnad lätt kan samlasin 15. P. lanceolata är den vanligast studerade arten i släktet Plantago; en artikel från 2021 rapporterade att det fanns >1 400 publikationer inklusive eller relaterade till denna art vid den tiden16, och ytterligare 102 artiklar har publicerats sedan början av 2022, enligt en PubMed-sökning som genomfördes den 9december 2022. Den näst mest studerade växten i släktet, P. major, är föremål för endast 414 artiklar när den söktes med samma kriterier samma datum.
Trots forskningsintresset för P. lanceolata begränsas studier, särskilt om genfunktionskarakterisering, ofta av bristen på en genetisk manipulationsverktygslåda för arten. Pommerrienig et al. gjorde ansträngningar för att utveckla ett transformationsprotokoll för P. major med hjälp av en blommig doppteknik17. Denna metod kan dock inte tillämpas på P. lanceolata på grund av den manliga sterilitetskarakteristiken för denna art18,19. Såvitt vi vet finns det inget befintligt protokoll för omvandling av P. lanceolata.
Denna studie presenterar ett enkelt protokoll för A. tumefaciens-medierad transformation av P. lanceolata. Genom att rikta rotvävnader kan fullvuxna transgena växter genereras inom 3 månader efter omvandling.
Avsaknaden av ett transformationsprotokoll för växter i släktet Plantago begränsar användningen av dessa växter som modeller, särskilt när forskare är intresserade av att utforska genfunktioner. P. lanceolata valdes för att utveckla ett genetiskt transformationsprotokoll eftersom det är den mest studerade växten i sitt släkte16. Protokollet som har utvecklats kommer sannolikt att användas som ett verktyg för att ytterligare främja studier relaterade till vaskulärbiologi, ekologi, växt-insektsinteraktioner och abiotisk stressfysiologi.
Protokollet som presenteras beskriver tydligt steg som gör det möjligt för en användare att få transgena växter. Förutom P. lanceolatas förmåga att trivas i en vävnadsodlingsmiljö bidrog flera faktorer till framgången för vår transformationsmetod. Först observerades vikten av att använda högkvalitativ, steril växtrotvävnad för transformation. Rötter hade de högsta omvandlingshastigheterna när de togs från 3-4 veckor gamla växter och verkade gröna eller blekvita. Rötter som togs från lådor med någon mängd bakteriell eller svampförorening resulterade ofta i förorenade skottkulturer, och äldre rötter som verkade bruna resulterade inte i framgångsrik omvandling. Rotvävnad var den mest effektiva vävnadstypen för transformation med den nuvarande metoden, eftersom blad- och bladvävnad misslyckades med att utveckla skott.
En annan viktig observation var att den optimala metoden för att samla rotvävnad för omvandling var att placera nyklippt rotmaterial i sterilt vatten. Detta steg tillät effektivt rotmaterial att förbli hydratiserat medan resten av vävnaden samlades in, eftersom rötter tenderar att torka ut snabbt när de tas bort från sina tillväxtbehållare. Detta steg bidrog också till att öka framgångsgraden för omvandlingen, eftersom det tillät fler rötter att inkuberas i bakterierna samtidigt.
Detta protokoll kan modifieras genom att minska tiden som rotvävnaden inkuberar i samodlingsmediet till 2 dagar. Det observerades att en 2 eller 3 dagars inkubationsperiod är tillräcklig för att tillåta infektion som resulterar i skottinitialer. Längre inkubationstider rekommenderas dock inte, eftersom det observerades att frånvaron av en antibiotikahämmare i media ofta resulterar i överväxt av A. tumefaciens , vilket kan döda den framväxande vävnaden.
En begränsning av denna studie är bristen på tillgängliga data om prestanda för andra metoder eller arter av A. tumefaciens i P. lanceolata transformation för jämförelse. Såvitt vi vet är detta protokoll nytt. Under de första försöken noterades en hög omvandlingseffektivitet med A. tumefaciens GV3101, och vi fokuserade på att förfina tekniken med hjälp av denna stam istället för att experimentera med andra stammar. Vår omvandlingseffektivitet på 20% är relativt hög för växtomvandling – många konventionella metoder anser att allt >1% är framgångsrikt26,27,28. Att använda en annan stam av A. tumefaciens, såsom A. rhizogenes, känd för sin användning i rottransformation hos flera arter 29,30,31, kan dock resultera i en ännu högre framgångsgrad. Ytterligare experiment skulle behövas för att bedöma effekterna av att använda andra stammar för att främja ökad omvandlingseffektivitet i P. lanceolata.
Den framgångsrika omvandlingen av P. lanceolata kommer sannolikt att gynna många studier. Den höga omvandlingseffektiviteten och den snabba tillväxten av växten i vävnadsodlingsmedier gör P. lanceolata till en genomförbar kandidat för genfunktionsstudier15.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Science Foundation (EDGE IOS-1923557 till C.Z. och Y.Z.).
14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34 | ThermoFisher Scientific | 150268 | |
1-Naphthylacetic acid | Gold Biotechnology | N-780 | |
3M Micropore Surgical Paper Tape | ThermoFisher Scientific | 19-027761 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Research Products International Corp. | 163227LC | |
600 Watt High Pressure Sodium Lights | Plantmax | PX-LU600 | |
6-Benzylaminopurine (6-BAP) | Gold Biotechnology | B-110 | |
Aluminum Foil | ThermoFisher Scientific | 01-213-100 | |
Bacto Agar | Thermofisher Scientific | 214010 | |
Binary Plasmid pBI101 | Clontech, USA | 632522 | |
Cool White Grow Light Sylvania LLC | Home Depot | 315952205 | |
D-biotin | ThermoFisher Scientific | BP232-1 | |
ddH2O | |||
DH5a E. coli | Invitrogen, USA | 18258012 | |
Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875714G | |
Dissecting Scissors | Leica Biosystems | 38DI12044 | |
Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705 | |
Folic Acid | Fisher Scientific | BP2519-5 | |
Forceps | Leica Biosystems | 38DI18031 | |
Gelrite | Research Products International Corp. | G35020-1000 | |
Glycerol | ThermoFisher Scientific | 17904 | |
Glycine | Sigma | 241261 | |
Incubated Tabletop Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | SHKE420HP | |
Indole-3-Acetic Acid (IAA) | Gold Biotechnology | I-110 | |
Indole-3-Butyric Acid (IBA) | Gold Biotechnology | I-180 | |
Kanamycin Monosulfate | Gold Biotechnology | K-120 | |
Macrocentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
Magenta Boxes | ThermoFisher Scientific | 50255176 | |
Micro Pipet Tips 1000 µL | Corning | 4140 | |
Micro Pipet Tips 200 µL | Corning | 4138 | |
Micro Pipette Tips 10 µL | Corning | 4135 | |
Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002410 | |
Micropipettor 0.5-10 µL | Corning | 4071 | |
Micropipettor 100-1000 µL | Corning | 4075 | |
Micropipettor 20-200 µL | Corning | 4074 | |
Micropipettor 2-20 µL | Corning | 4072 | |
Murashige & Skooge Basal Medium with Vitamins | PhytoTech | M519 | |
Murashige & Skooge Basal Salt Mixture | PhytoTech | M524 | |
myo-Inositol | Gold Biotechnology | I-25 | |
Nicotinic acid | Sigma | N0761-100g | |
Parafilm (paraffin film) | ThermoFisher Scientific | S37440 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Research Products International Corp. | P44000 | |
Pyridoxine HCl | Sigma | P6280-10g | |
Scalpel Blade Handle | Leica Biosystems | 38DI36419 | |
Scalpel Blades | Leica Biosystems | 3802181 | |
Sodium Chloride, Crystal (NaCl) | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Research Products International Corp. | S24000 | |
Sodium Hypochlorite | Walmart | 23263068401 | |
Soil- Bark Mix | Berger, USA | BM7 | |
Square Pots (3.5 inches squared) | Greenhouse Megastore | CN-TRK-1835 | |
Sucrose | Research Products International Corp. | S24060 | |
Thermocycler | ThermoFisher Scientific | A24811 | |
Thiamine HCl | Sigma | T4625-5G | |
Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin) | Gold Biotechnology | T-104 | |
trans-Zeatin Riboside (ZR) | Gold Biotechnology | Z-100 | |
Tryptone | Thermofisher Scientific | 211705 | |
Wild Type Plantago lanceolata seeds | Outsidepride Seed Source, OR, USA | F1296 | Outsidepride.com |
Yeast Extract Granulated | Research Products International Corp. | Y20025-1000 |