Ex vivo Udvidelse og genetisk manipulation af hæmatopoietiske stamceller fra mus i polyvinylalkoholbaserede kulturer
Summary
Præsenteret her er en protokol til initiering, vedligeholdelse og analyse af musehæmatopoietiske stamcellekulturer ved hjælp af ex vivo polyvinylalkoholbaseret ekspansion samt metoder til genetisk manipulation af dem ved lentiviral transduktion og elektroporation.
Abstract
Selvfornyende multipotente hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) er en vigtig celletype på grund af deres evne til at understøtte hæmatopoiesis gennem hele livet og rekonstituere hele blodsystemet efter transplantation. HSC’er anvendes klinisk i stamcelletransplantationsterapier, som repræsenterer helbredende behandling for en række blodsygdomme. Der er stor interesse for både at forstå de mekanismer, der regulerer HSC-aktivitet og hæmatopoiese, og udvikle nye HSC-baserede terapier. Imidlertid har den stabile kultur og udvidelse af HSC’er ex vivo været en stor barriere for at studere disse stamceller i et medgørligt ex vivo-system. Vi har for nylig udviklet et polyvinylalkoholbaseret dyrkningssystem, der kan understøtte den langsigtede og storstilede udvidelse af transplanterelige HSC’er til mus og metoder til genetisk redigering af dem. Denne protokol beskriver metoder til dyrkning og genetisk manipulation af HSC’er til mus via elektroporation og lentiviral transduktion. Denne protokol forventes at være nyttig for en bred vifte af eksperimentelle hæmatologer, der er interesseret i HSC-biologi og hæmatopoiesis.
Introduction
Det hæmatopoietiske system understøtter en række vigtige processer hos pattedyr, fra iltforsyning til bekæmpelse af patogener, gennem specialiserede blod- og immuncelletyper. Kontinuerlig blodproduktion (hæmatopoiese) er nødvendig for at understøtte blodsystemets homeostase, som opretholdes af hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC’er)1. Den mest primitive hæmatopoietiske celle er den hæmatopoietiske stamcelle (HSC), som har unikke kapaciteter til selvfornyelse og multilineagedifferentiering 2,3. Dette er en sjælden cellepopulation, der hovedsageligt findes i den voksne knoglemarv4, hvor de forekommer med en frekvens på kun ca. en hver 30.000 celler. HSC’er menes at understøtte livslang hæmatopoiesis og hjælpe med at genoprette hæmatopoiesis efter hæmatologisk stress. Denne kapacitet gør det også muligt for HSC’er stabilt at rekonstituere hele det hæmatopoietiske system efter transplantation til en bestrålet recipient5. Dette repræsenterer den funktionelle definition af en HSC og danner også det videnskabelige grundlag for HSC-transplantationsterapi, en helbredende behandling af en række blod- og immunsygdomme6. Af disse grunde er HSC’er et vigtigt fokus for eksperimentel hæmatologi.
På trods af et stort forskningsfokus har det fortsat været udfordrende at stabilt udvide HSC’er ex vivo7. Vi har for nylig udviklet det første langsigtede ex vivo-ekspansionskultursystem til HSC’er8 til mus. Tilgangen kan udvide transplanterelige HSC’er med 234-899 gange over en 4 ugers kultur. I sammenligning med alternative tilgange var den største ændring i protokollen fjernelsen af serumalbumin og dets erstatning med en syntetisk polymer. Polyvinylalkohol (PVA) blev identificeret som en optimal polymer til HSC-kulturer8 hos mus, som nu også er blevet brugt til dyrkning af andre hæmatopoietiske celletyper9. Imidlertid er en anden polymer kaldet Soluplus (en polyvinylcaprolactam-acetat-polyethylenglycolgraft-copolymer) også for nylig blevet identificeret, hvilket ser ud til at forbedre klonal HSC-ekspansion10. Før anvendelse af polymerer blev serumalbumin i form af føtalt bovint serum, bovin serumalbumin fraktion V eller rekombinant serumalbumin anvendt, men disse havde begrænset støtte til HSC-ekspansion og understøttede kun kortvarig (~ 1 uge) ex vivo-kultur 7. Det skal dog bemærkes, at HSC-kulturprotokoller, der bevarer HSC’er i hviletilstand, kan understøtte en længere ex vivo-kulturtid11,12.
I sammenligning med andre dyrkningsmetoder er en stor fordel ved PVA-baserede kulturer antallet af celler, der kan genereres, og hvor lang tid protokollen kan bruges til at spore HSC’er ex vivo. Dette overvinder flere barrierer inden for eksperimentel hæmatologi, såsom det lave antal HSC’er, der kan isoleres pr. mus (kun et par tusinde) og vanskeligheden ved at spore HSC’er over tid in vivo. Det er dog vigtigt at huske, at disse kulturer stimulerer HSC-spredning, mens in vivo HSC-puljen overvejende er hvilende ved en stabil tilstand13. Selvom kulturerne er selektive for HSC’er, akkumuleres yderligere celletyper med kulturerne over tid, og transplanterelige HSC’er repræsenterer kun ca. en ud af 34 celler efter 1 måned. Myeloide hæmatopoietiske stamceller synes at være den største forurenende celletype i disse HSC-kulturer8. Ikke desto mindre kan vi bruge disse kulturer til at berige HSC’er fra heterogene cellepopulationer (f.eks. c-Kit+ knoglemarv HSPC’er14). Det understøtter også transduktion eller elektroporation af HSC’er til genetisk manipulation14,15,16. For at hjælpe med at identificere HSC’er fra den heterogene dyrkede HSPC-population er CD201 (EPCR) for nylig blevet identificeret som en nyttig ex vivo HSC-markør10,17,18, med transplanterelige HSC’er begrænset til CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-fraktionen.
Denne protokol beskriver metoder til at initiere, vedligeholde og vurdere PVA-baserede HSC-ekspansionskulturer med mus samt protokoller til genetisk manipulation inden for disse kulturer ved hjælp af elektroporation eller lentiviral vektortransduktion. Disse metoder forventes at være nyttige for en række eksperimentelle hæmatologer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi håber, at denne protokol giver en nyttig tilgang til at undersøge HSC-biologi, hæmatopoiesis og hæmatologi mere generelt. Siden den indledende udvikling af den PVA-baserede dyrkningsmetode til FACS-rensede HSC’er8 er metoden blevet udvidet. For eksempel har metoden vist sig at virke med c-Kit beriget med knoglemarv og med negative overfladeladede plader14. Dens kompatibilitet med transduktion og elektroporation er også blevet påvist14,15<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker WIMM Flow Cytometry Core for flowcytometriadgang og WIMM Virus Screening Core for lentiviral vektorgenerering. Dette arbejde blev finansieret af Kay Kendall Leukæmi Fund og UK Medical Research Council.
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
Riferimenti
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson, ., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
