Ex Vivo Uitbreiding en genetische manipulatie van hematopoëtische stamcellen van muizen in op polyvinylalcohol gebaseerde culturen
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het initiëren, onderhouden en analyseren van hematopoëtische stamcelculturen van muizen met behulp van ex vivo polyvinylalcoholgebaseerde expansie, evenals methoden om ze genetisch te manipuleren door lentivirale transductie en elektroporatie.
Abstract
Zelfvernieuwende multipotente hematopoietische stamcellen (HSC’s) zijn een belangrijk celtype vanwege hun vermogen om hematopoëse gedurende het hele leven te ondersteunen en het hele bloedsysteem na transplantatie te reconstrueren. HSC’s worden klinisch gebruikt in stamceltransplantatietherapieën, die een curatieve behandeling voor een reeks bloedziekten vertegenwoordigen. Er is veel belangstelling voor zowel het begrijpen van de mechanismen die HSC-activiteit en hematopoëse reguleren, als het ontwikkelen van nieuwe HSC-gebaseerde therapieën. De stabiele kweek en uitbreiding van HSC’s ex vivo is echter een belangrijke barrière geweest bij het bestuderen van deze stamcellen in een handelbaar ex vivo systeem. We hebben onlangs een op polyvinylalcohol gebaseerd kweeksysteem ontwikkeld dat de langdurige en grootschalige uitbreiding van transplanteerbare HSC’s van muizen en methoden om ze genetisch te bewerken kan ondersteunen. Dit protocol beschrijft methoden om HSC’s van muizen te kweken en genetisch te manipuleren via elektroporatie en lentivirale transductie. Dit protocol zal naar verwachting nuttig zijn voor een breed scala aan experimentele hematologen die geïnteresseerd zijn in HSC-biologie en hematopoiese.
Introduction
Het hematopoietische systeem ondersteunt een reeks essentiële processen bij zoogdieren, van zuurstoftoevoer tot het bestrijden van ziekteverwekkers, via gespecialiseerde bloed- en immuunceltypen. Continue bloedproductie (hematopoiese) is nodig ter ondersteuning van de homeostase van het bloedsysteem, die wordt ondersteund door hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC’s)1. De meest primitieve hematopoëtische cel is de hematopoietische stamcel (HSC), die unieke capaciteiten heeft voor zelfvernieuwing en multilineage differentiatie 2,3. Dit is een zeldzame celpopulatie, voornamelijk te vinden in het volwassen beenmerg4, waar ze voorkomen met een frequentie van slechts ongeveer één per 30.000 cellen. Van HSC’s wordt gedacht dat ze levenslange hematopoiese ondersteunen en helpen om hematopoiese te herstellen na hematologische stress. Deze capaciteiten stellen HSC’s ook in staat om het gehele hematopoietische systeem stabiel te reconstrueren na transplantatie in een bestraalde ontvanger5. Dit vertegenwoordigt de functionele definitie van een HSC en vormt ook de wetenschappelijke basis voor HSC-transplantatietherapie, een curatieve behandeling voor een reeks bloed- en immuunziekten6. Om deze redenen zijn HSC’s een belangrijk aandachtspunt van de experimentele hematologie.
Ondanks een grote focus van onderzoek, is het een uitdaging gebleven om HSC’s ex vivo7 stabiel uit te breiden. We hebben onlangs het eerste langdurige ex vivo expansiecultuursysteem voor muis HSCs8 ontwikkeld. De aanpak kan transplanteerbare HSC’s 234-899-voudig uitbreiden over een cultuur van 4 weken. In vergelijking met alternatieve benaderingen was de belangrijkste verandering in het protocol de verwijdering van serumalbumine en de vervanging ervan door een synthetisch polymeer. Polyvinylalcohol (PVA) werd geïdentificeerd als een optimaal polymeer voor de HSC-culturen van de muis8, die nu ook is gebruikt om andere hematopoëtische celtypen9 te kweken. Een ander polymeer genaamd Soluplus (een polyvinylcaprolactam-acetaat-polyethyleenglycol-transplantaatcopolymeer) is echter onlangs ook geïdentificeerd, wat de klonale HSC-expansie lijkt te verbeteren10. Voorafgaand aan het gebruik van polymeren werden serumalbumine in de vorm van foetaal runderserum, runderserumalbuminefractie V of recombinant serumalbumine gebruikt, maar deze hadden beperkte ondersteuning voor HSC-expansie en ondersteunden alleen kortdurende (~ 1 week) ex vivo cultuur7. Er moet echter worden opgemerkt dat HSC-cultuurprotocollen die HSC’s in een rustige toestand houden, een langere ex vivo cultuurtijd11,12 kunnen ondersteunen.
In vergelijking met andere kweekmethoden is een groot voordeel van PVA-gebaseerde culturen het aantal cellen dat kan worden gegenereerd en de tijdsduur dat het protocol kan worden gebruikt om HSC’s ex vivo te volgen. Dit overwint verschillende barrières op het gebied van experimentele hematologie, zoals het lage aantal HSC’s dat per muis kan worden geïsoleerd (slechts een paar duizend) en de moeilijkheid om HSC’s in de loop van de tijd in vivo te volgen. Het is echter belangrijk om te onthouden dat deze culturen HSC-proliferatie stimuleren, terwijl de in vivo HSC-pool overwegend rustig is bij een steady state13. Bovendien, hoewel de culturen selectief zijn voor HSC’s, hopen extra celtypen zich in de loop van de tijd op met de culturen, en transplanteerbare HSC’s vertegenwoordigen slechts ongeveer één op de 34 cellen na 1 maand. Myeloïde hematopoëtische voorlopercellen lijken het belangrijkste verontreinigende celtype te zijn in deze HSC-culturen8. Niettemin kunnen we deze culturen gebruiken om te verrijken voor HSC’s uit heterogene celpopulaties (bijv. c-Kit + beenmerg HSPC’s14). Het ondersteunt ook transductie of elektroporatie van HSC’s voor genetische manipulatie14,15,16. Om HSC’s uit de heterogene gekweekte HSPC-populatie te helpen identificeren, is CD201 (EPCR) onlangs geïdentificeerd als een nuttige ex vivo HSC-marker 10,17,18, met transplanteerbare HSC’s beperkt tot de CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-fractie.
Dit protocol beschrijft methoden voor het initiëren, onderhouden en beoordelen van op PVA gebaseerde HSC-expansieculturen van muizen, evenals protocollen voor genetische manipulatie binnen deze culturen met behulp van elektroporatie of lentivirale vectortransductie. Deze methoden zullen naar verwachting nuttig zijn voor een reeks experimentele hematologen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hopen dat dit protocol een nuttige benadering biedt om HSC-biologie, hematopoëse en hematologie in het algemeen te onderzoeken. Sinds de initiële ontwikkeling van de PVA-gebaseerde kweekmethode voor FACS-gezuiverde HSC’s8 is de methode uitgebreid. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat de methode werkt met c-Kit verrijkt met beenmerg en met negatieve oppervlaktegeladen platen14. De compatibiliteit met transductie en elektroporatie is ook aangetoond14,15</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken de WIMM Flow Cytometry Core voor toegang tot flowcytometrie en de WIMM Virus Screening Core voor lentivirale vectorgeneratie. Dit werk werd gefinancierd door het Kay Kendall Leukaemia Fund en de UK Medical Research Council.
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
Riferimenti
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson, ., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
