Ex Vivo Expansão e Manipulação Genética de Células-Tronco Hematopoéticas de Camundongos em Culturas à Base de Álcool Polivinílico
Summary
Apresentamos aqui um protocolo para iniciar, manter e analisar culturas de células-tronco hematopoéticas de camundongos usando expansão ex vivo à base de álcool polivinílico, bem como métodos para manipulá-las geneticamente por transdução lentiviral e eletroporação.
Abstract
As células-tronco hematopoéticas (CTHs) multipotentes auto-renovadoras são um tipo celular importante devido à sua capacidade de suportar a hematopoiese ao longo da vida e reconstituir todo o sistema sanguíneo após o transplante. As CTHs são usadas clinicamente em terapias de transplante de células-tronco, que representam tratamento curativo para uma série de doenças do sangue. Há um interesse substancial tanto na compreensão dos mecanismos que regulam a atividade da TH e da hematopoiese, quanto no desenvolvimento de novas terapias baseadas em HSC. No entanto, o cultivo estável e a expansão de CTHs ex vivo têm sido uma grande barreira no estudo dessas células-tronco em um sistema ex vivo tratável. Recentemente, desenvolvemos um sistema de cultura à base de álcool polivinílico que pode apoiar a expansão a longo prazo e em larga escala de HSCs transplantáveis de camundongos e métodos para editá-los geneticamente. Este protocolo descreve métodos para cultura e manipulação genética de HSCs de camundongos via eletroporação e transdução lentiviral. Espera-se que este protocolo seja útil para uma ampla gama de hematologistas experimentais interessados em biologia da CAR e hematopoese.
Introduction
O sistema hematopoiético suporta uma série de processos essenciais em mamíferos, desde o fornecimento de oxigênio até o combate a patógenos, passando por tipos especializados de células sanguíneas e imunológicas. A produção contínua de sangue (hematopoiese) é necessária para dar suporte à homeostase do sistema sanguíneo, que é sustentada por células-tronco hematopoéticas e células progenitoras (HSPCs)1. A célula hematopoética mais primitiva é a célula-tronco hematopoética (CTH), que possui capacidades únicas de auto-renovação e diferenciação de multilinhagens2,3. Esta é uma população celular rara, encontrada principalmente na medula óssea adulta4, onde ocorrem com uma frequência de apenas aproximadamente uma a cada 30.000 células. Acredita-se que as CTHs apoiem a hematopoiese ao longo da vida e ajudem a restabelecer a hematopoiese após o estresse hematológico. Essas capacidades também permitem que as HSCs reconstituam de forma estável todo o sistema hematopoiético após o transplante em um receptor irradiado5. Isso representa a definição funcional de uma CAR e também forma a base científica para a terapia de transplante de THC, um tratamento curativo para uma série de doenças hematológicas e imunológicas6. Por essas razões, as HSCs são um dos principais focos da hematologia experimental.
Apesar de um grande foco de pesquisa, tem permanecido desafiador expandir de forma estável HSCs ex vivo7. Recentemente, desenvolvemos o primeiro sistema de cultura de expansão ex vivo de longo prazo para HSCs de camundongos8. A abordagem pode expandir HSCs transplantáveis em 234-899 vezes ao longo de uma cultura de 4 semanas. Em comparação com abordagens alternativas, a principal mudança no protocolo foi a remoção da albumina sérica e sua substituição por um polímero sintético. O álcool polivinílico (PVA) foi identificado como um polímero ótimo para culturas de HSC em camundongos8, que agora também tem sido usado para culturas de outros tipos de células hematopoéticas9. No entanto, outro polímero chamado Soluplus (um copolímero de enxerto de polivinil caprolactama-acetato-polietilenoglicol) também foi identificado recentemente, o que parece melhorar a expansão clonal de CTE10. Antes do uso de polímeros, albumina sérica na forma de soro fetal bovino, albumina sérica V de soro bovino ou albumina sérica recombinante eram usadas, mas estas tinham suporte limitado para expansão de CTE e suportavam apenas cultura ex vivo de curto prazo (~1 semana)7. No entanto, deve-se ressaltar que protocolos de cultura de CAR que retêm as HSC em estado quiescente podem suportar um tempo de cultura ex vivo maior11,12.
Em comparação com outros métodos de cultura, uma grande vantagem das culturas baseadas em PVA é o número de células que podem ser geradas e o tempo que o protocolo pode ser usado para rastrear HSCs ex vivo. Isso supera várias barreiras no campo da hematologia experimental, como o baixo número de HSCs isoláveis por camundongo (apenas alguns milhares) e a dificuldade de rastrear HSCs ao longo do tempo in vivo. No entanto, é importante lembrar que essas culturas estimulam a proliferação de HSC, enquanto o pool de HSC in vivo é predominantemente quiescente em estado estacionário13. Além disso, embora as culturas sejam seletivas para CTHs, tipos celulares adicionais se acumulam com as culturas ao longo do tempo, e as CTHs transplantáveis representam apenas aproximadamente uma em cada 34 células após 1 mês. As células progenitoras hematopoéticas mieloides parecem ser o principal tipo celular contaminante nessas culturas deCTH8. No entanto, podemos usar essas culturas para enriquecer para HSCs de populações celulares heterogêneas (por exemplo, c-Kit+ HSPCs de medula óssea14). Também suporta a transdução ou eletroporação de CTHs para manipulação genética14,15,16. Para ajudar a identificar HSCs da população heterogênea de HSPC cultivadas, CD201 (EPCR) foi recentemente identificado como um marcador útil ex vivo de HSC10,17,18, com HSCs transplantáveis restritas à fração CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-.
Este protocolo descreve métodos para iniciar, manter e avaliar culturas de expansão de HSC de camundongos baseadas em PVA, bem como protocolos para manipulação genética dentro dessas culturas usando eletroporação ou transdução de vetor lentiviral. Espera-se que esses métodos sejam úteis para uma variedade de hematologistas experimentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esperamos que este protocolo forneça uma abordagem útil para investigar a biologia da THS, hematopoese e hematologia de forma mais geral. Desde o desenvolvimento inicial do método de cultura à base de PVA para HSCs purificadas porFACS8, o método tem sido ampliado. Por exemplo, foi demonstrado que o método funciona com c-Kit enriquecido com medula óssea e com placas carregadas superficialmentenegativas14. Sua compatibilidade com transdução e eletroporação também …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao WIMM Flow Cytometry Core pelo acesso à citometria de fluxo e ao WIMM Virus Screening Core pela geração do vetor lentiviral. Este trabalho foi financiado pelo Kay Kendall Leukaemia Fund e pelo UK Medical Research Council.
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
Riferimenti
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson, ., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
