Ex Vivo Expansion och genetisk manipulation av mushematopoetiska stamceller i polyvinylalkoholbaserade kulturer
Summary
Här presenteras ett protokoll för att initiera, underhålla och analysera hematopoetiska stamcellskulturer hos möss med användning av ex vivo polyvinylalkoholbaserad expansion, samt metoder för att genetiskt manipulera dem genom lentiviral transduktion och elektroporering.
Abstract
Självförnyande multipotenta hematopoetiska stamceller (HSC) är en viktig celltyp på grund av deras förmåga att stödja hematopoes under hela livet och rekonstituera hela blodsystemet efter transplantation. HSC används kliniskt i stamcellstransplantationsterapier, som representerar botande behandling för en rad blodsjukdomar. Det finns ett stort intresse för att både förstå mekanismerna som reglerar HSC-aktivitet och hematopoes och utveckla nya HSC-baserade terapier. Den stabila odlingen och expansionen av HSCs ex vivo har dock varit ett stort hinder för att studera dessa stamceller i ett lätthanterligt ex vivo-system. Vi utvecklade nyligen ett polyvinylalkoholbaserat odlingssystem som kan stödja långsiktig och storskalig expansion av transplanterbara mus-HSC och metoder för att genetiskt redigera dem. Detta protokoll beskriver metoder för att odla och genetiskt manipulera HSC hos möss via elektroporering och lentiviral transduktion. Detta protokoll förväntas vara användbart för ett brett spektrum av experimentella hematologer intresserade av HSC-biologi och hematopoies.
Introduction
Det hematopoietiska systemet stöder en rad viktiga processer hos däggdjur, från syretillförsel till bekämpning av patogener, genom specialiserade blod- och immuncelltyper. Kontinuerlig blodproduktion (hematopoies) krävs för att stödja blodsystemets homeostas, som upprätthålls av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC)1. Den mest primitiva hematopoetiska cellen är den hematopoetiska stamcellen (HSC), som har unik kapacitet för självförnyelse och multilineagedifferentiering 2,3. Detta är en sällsynt cellpopulation, som främst finns i den vuxna benmärgen4, där de förekommer med en frekvens av bara ungefär en var 30 000 celler. HSC tros stödja livslång hematopoes och hjälpa till att återupprätta hematopoies efter hematologisk stress. Dessa kapaciteter gör det också möjligt för HSC att stabilt rekonstituera hela det hematopoetiska systemet efter transplantation till en bestrålad mottagare5. Detta representerar den funktionella definitionen av en HSC och utgör också den vetenskapliga grunden för HSC-transplantationsterapi, en botande behandling för en rad blod- och immunsjukdomar6. Av dessa skäl är HSC ett stort fokus för experimentell hematologi.
Trots ett stort forskningsfokus har det varit utmanande att stabilt utöka HSC ex vivo7. Vi utvecklade nyligen det första långsiktiga ex vivo-expansionsodlingssystemet för mus HSC8. Tillvägagångssättet kan expandera transplanterbara HSC med 234-899 gånger över en 4 veckors kultur. I jämförelse med alternativa tillvägagångssätt var den största förändringen i protokollet avlägsnandet av serumalbumin och dess ersättning med en syntetisk polymer. Polyvinylalkohol (PVA) identifierades som en optimal polymer för mössens HSC-kulturer8, som nu också har använts för att odla andra hematopoetiska celltyper9. Emellertid har en annan polymer som heter Soluplus (en polyvinylkaprolaktamacetat-polyetylenglykolgraftsampolymer) också nyligen identifierats, vilket verkar förbättra klonal HSC-expansion10. Före användning av polymerer användes serumalbumin i form av fetalt bovint serum, bovint serumalbuminfraktion V eller rekombinant serumalbumin, men dessa hade begränsat stöd för HSC-expansion och stödde endast kortvarig (~ 1 vecka) ex vivo-kultur 7. Det bör dock noteras att HSC-odlingsprotokoll som håller HSC i vilande tillstånd kan stödja en längre ex vivo-odlingstid 11,12.
I jämförelse med andra odlingsmetoder är en stor fördel med PVA-baserade kulturer antalet celler som kan genereras och hur lång tid protokollet kan användas för att spåra HSC ex vivo. Detta övervinner flera hinder inom experimentell hematologi, såsom det låga antalet HSC som kan isoleras per mus (bara några tusen) och svårigheten att spåra HSC över tid in vivo. Det är dock viktigt att komma ihåg att dessa kulturer stimulerar HSC-proliferation, medan in vivo HSC-poolen huvudsakligen är vilande vid ett stabilt tillstånd13. Dessutom, även om kulturerna är selektiva för HSC, ackumuleras ytterligare celltyper med kulturerna över tiden, och transplanterbara HSC representerar endast ungefär en av 34 celler efter 1 månad. Myeloida hematopoetiska stamceller verkar vara den huvudsakliga förorenande celltypen i dessa HSC-kulturer8. Ändå kan vi använda dessa kulturer för att berika HSC från heterogena cellpopulationer (t.ex. c-Kit + benmärgs HSPC14). Det stöder också transduktion eller elektroporering av HSC för genetisk manipulation14,15,16. För att hjälpa till att identifiera HSC från den heterogena odlade HSPC-populationen har CD201 (EPCR) nyligen identifierats som en användbar ex vivo HSC-markör 10,17,18, med transplanterbara HSC begränsade till CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-fraktionen.
Detta protokoll beskriver metoder för att initiera, underhålla och utvärdera PVA-baserade mus HSC-expansionskulturer, samt protokoll för genetisk manipulation inom dessa kulturer med hjälp av elektroporering eller lentiviral vektortransduktion. Dessa metoder förväntas vara användbara för en rad experimentella hematologer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi hoppas att detta protokoll ger ett användbart tillvägagångssätt för att undersöka HSC-biologi, hematopoes och hematologi mer allmänt. Sedan den initiala utvecklingen av den PVA-baserade odlingsmetoden för FACS-renade HSCs8 har metoden utvidgats. Till exempel har metoden visat sig fungera med c-Kit berikad med benmärg och med negativa ytladdade plattor14. Dess kompatibilitet med transduktion och elektroporering har också visats14,15<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar WIMM Flow Cytometry Core för åtkomst till flödescytometri och WIMM Virus Screening Core för lentiviral vektorgenerering. Detta arbete finansierades av Kay Kendall Leukaemia Fund och UK Medical Research Council.
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
Riferimenti
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson, ., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
