Her presenterer vi en protokoll for å isolere kjerner fra flashfrosset, arkivert levervev for enkeltkjerne RNA-seq, ATAC-seq og felles multiomikk (RNA-seq og ATAC-seq).
Leveren er et komplekst og heterogent vev som er ansvarlig for å utføre mange kritiske fysiologiske funksjoner, for eksempel vedlikehold av energihomeostase og metabolisme av xenobiotika, blant andre. Disse oppgavene utføres gjennom tett koordinering mellom hepatiske parenkymale og ikke-parenkymale celler. I tillegg er ulike metabolske aktiviteter begrenset til bestemte områder av leveren lobule-et fenomen som kalles lever sonering. Nylige fremskritt innen enkeltcellesekvenseringsteknologier har gitt forskere mulighet til å undersøke vevs heterogenitet ved encellet oppløsning. I mange komplekse vev, inkludert leveren, kan sterke enzymatiske og / eller mekaniske dissosiasjonsprotokoller negativt påvirke levedyktigheten eller kvaliteten på enkeltcellesuspensjonene som trengs for å karakterisere dette organet i helse og sykdom.
Dette papiret beskriver en robust og reproduserbar protokoll for å isolere kjerner fra frosne, arkiverte levervev. Denne metoden gir kjerner av høy kvalitet som er kompatible med nedstrøms, enkeltcellede omics-tilnærminger, inkludert enkeltkjerne RNA-seq, analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (ATAC-seq), samt multimodale omics (felles RNA-seq og ATAC-seq). Denne metoden har blitt vellykket brukt til isolering av kjerner fra friske og syke humane, mus og ikke-menneskelige primatfrosne leverprøver. Denne tilnærmingen tillater upartisk isolasjon av alle de store celletyper i leveren, og tilbyr derfor en robust metodikk for å studere leveren ved encellet oppløsning.
Encellet genomikk blir raskt en viktig metodikk for å studere leverfunksjon og vurdere virkningen av cellulær heterogenitet i helse- ogsykdomstilstander 1. Den raske utviklingen av “multiomics” for samtidig måling av forskjellige lag med informasjon og den parallelle utvidelsen av robuste beregningsrørledninger baner vei for oppdagelsen av tidligere ukjente celletyper og subtyper i normal og syk lever2.
Muligheten for å utforske biobanker og arkiverte frosne prøver har betydelig økt mulighetene for å revidere og oppdage rollen som ikke-parenkymale celler 3,4,5 og undersøke rollen som polyploide hepatocytter under aldring og i kroniske sykdommer 6,7,8,9 . Derfor beskriver dette papiret en robust og reproduserbar enkeltkjerneisolasjonsprotokoll for flashfrosne (FF) arkiverte lever som er kompatible med nedstrøms enkeltkjerne RNA-sekvensering og ATAC-sekvensering, samt med multimodale omics (felles RNA-seq og ATAC-seq) (figur 1).
Denne arbeidsflyten tillater undersøkelse av transkriptomet og kromatintilgjengeligheten til alle celletyper i leveren, uavhengig av cellestørrelse eller skjørhet, i enzymatiske dissosiasjonsprotokoller. Det kan utføres med små vevsseksjoner (15-30 mg eller 5-10 mm3) fra dyrebare menneskelige prøver eller transgene mus. Bestemmelse av den høye renheten av kjerneisolasjonen inkluderer kvantifisering og måling av kjernestørrelsen, som kan korrelere med økt cellestørrelse og senescens 10,11, og denne renheten er relevant for analysen av både hepatocyttploidi12 og cellestørrelsesavhengige transkripsjonsmekanismer 11,13,14,15 . I tillegg beholder kjerner isolert fra frosne lever verdifull informasjon om leverzonering. Arbeidsflyten og vevsinnsamlingen tillater validering av enkeltcellegenomikkdata eller ytterligere komplementære analyser, for eksempel immunhistokjemi eller romlig transkriptomikk fra samme vev og samme individ. Derfor kan denne tilnærmingen brukes på flere leversykdomstilstander og modellere organismer systematisk og pålitelig.
Dissekering av leverens cellulære sammensetning ved encellet eller enkeltkjerne RNA-seq gir en dypere forståelse av leversykdomsutvikling og progresjon 3,4,5,24. Encellet isolasjon fra lever er tidkrevende og krever protokoller som involverer hard mekanisk eller enzymatisk dissosiasjon25,26,27. Det er allment akseptert at hvert vev krever en systematisk evaluering for å bestemme den optimale vevsdissosiasjonsprotokollen, samt en egnet lagringsmetode for å fange skjøre celletyper eller kjerner28. Avhengig av vevstilgjengelighet, sykdom av interesse, utviklingsstadium eller modellorganisme, kan fremstilling av en enkeltkjernesuspensjon for nedstrømsbehandling være en mer egnet metode enn å bruke encellede suspensjoner. Det er viktig at i leveren har scRNA-seq og snRNA-seq vist en høy korrelasjon mellom nukleært og cytoplasmatisk mRNA, noe som tyder på at begge tilnærmingene presenterer komplementær informasjon 2,3,4,6,29.
Dette papiret gir en standardisert, robust og reproduserbar enkeltkjerneisolasjon fra frosne, arkiverte leverprøver fra mus og andre arter, inkludert mennesker og makaker. Denne metoden kan brukes til villtypemus matet med chow og et fettfattig kosthold (HFD) og for musemodeller av leverfibrose ved bruk av både brønnplatebaserte og dråpebaserte enkeltkjernegenomiske tilnærminger6. Denne metoden er avhengig av protokollen beskrevet opprinnelig for hjernevev av Krishnaswami et al.30 med ytterligere modifikasjoner skreddersydd for flashfrosset lever. Optimal homogenisering frigjør de fleste kjernene fra vevet uten å påvirke kjernemembranintegriteten negativt. Overdouncing kan imidlertid skade de skjøre kjernene og redusere deres generelle kvalitet. Unge og / eller fettlever krever vanligvis bare 5 slag med pestle A og 10 slag med pestle B, mens gamle og / eller fibrotiske lever kan kreve 15 slag med pestle B, men ikke mer. Det anbefales derfor ikke å utføre flere slag utover tallene som er angitt her. Overdouncing kan negativt påvirke kvaliteten på enkeltkjernesuspensjonen og øke mengden omgivende RNA. Deretter kan dette føre til behov for å utføre ytterligere beregningsfiltreringstrinn under nedstrøms dataanalyser.
Protokollen som presenteres her er allsidig og kan justeres til forskjellige leverforhold hos unge (3 måneder) og gamle (24 måneder) mus. Siden vi fant at en større del av leveren er nødvendig for gamle, HFD og fibrotiske vev, kan størrelsen på vevet som er tilgjengelig for behandling, utgjøre en begrensning for noen brukere med mindre mengder startende biologisk materiale. Imidlertid anbefales gradientrensing sterkt for umiddelbar prøvebehandling med dråpebaserte genomiske analyser. Hvis kjernene må facs sorteres i 96-/384-brønnplater for brønnbaserte analyser, kan gradientrensing utelates. Vi oppfordrer brukere som fortsatt utfører gradientrensingen hvis det er nok vevsprøve til å oppnå den anbefalte kjernekonsentrasjonen for FACS-sortering (dvs. ~ 1 × 105 kjerner / ml).
Leveren er preget av den polyploide naturen til hepatocytter9, men rollen som hepatocyttpoidi i normal fysiologi og sykdom er ennå ikke klar. Det er en økende mengde bevis som indikerer at ploidi gir genomisk variabilitet31, og det er velkjent at ploidi øker med alderen32,33. Anrikningen av mononukleerte tetraploide hepatocytter er imidlertid også klinisk forbundet med dårlig prognose ved humant hepatocellulært karsinom (HCC)34. På samme måte er endringer i hepatocyttploidinivåer knyttet til aldringsrelaterte kroniske leversykdommer som ikke-alkoholholdig fettleversykdom (NAFLD)35,36,37. Ploidi er tilstanden for å ha mer enn to kopier av genomet, som kan utforskes ved å fargelegge genominnholdet med et DNA-fargestoff som Hoechst38. Hoechst-fargestoff, som tilsettes HB før ekstraksjon, merker alle kjernene under isolasjonsprotokollen. Dette gjør det mulig å skille mellom diploide og polyploide kjerner basert på deres DNA-innhold når de er eksitert av en UV (350 nm) eller fiolett (450 nm) laser på et flowcytometriinstrument. Med den viste gating-strategien kan 2n, 4n, 8n og høyere nivåer av hepatocyttpoidi undersøkes i frosne, arkiverte lever for bedre å forstå rollen som cellulær heterogenitet i vevsfunksjon1 (figur 3A). Videre kan kjernemorfologien, inkludert størrelse og volum, kvantifiseres ved hjelp av imaging flow cytometri for å korrelere endringer i kjernestørrelsen med endringer i totalt antall tellinger eller antall gener avhengig av ploidinivået (figur 3B, C).
Multimodal omics måling gir mulighet til å undersøke flere lag av genomisk organisasjon samtidig. Den felles RNA + ATAC multiomics-tilnærmingen tillater undersøkelse av oppstrøms regulatorer og nedstrøms metabolske gener, og gir en omfattende tilnærming for å studere transkripsjonsnettverk og kromatinarkitekturen assosiert med leverfunksjon ved enkeltcelleoppløsningen. Videre, med fremskritt innen beregningsmetoder som kan redegjøre for datamangel og reduksjon i sekvenseringskostnader, er enkeltcelle multiomikk banebrytende for vurderingen av flere modaliteter fra samme celle. Denne enkeltkjerneisolasjonsprotokollen er kompatibel med den individuelle og felles vurderingen av ekspresjons- og kromatindatasett. Vi har brukt standard rørledninger etablert av Stuart et al.23 (Signac-pakken) for å illustrere kvaliteten på dataene, mens flere tilgjengelige og alternative beregningsmetoder enkelt kan tas i bruk for nedstrømsanalyser23,39,40,41.
Samlet sett tillater enkeltkjerne multiomikk undersøkelse av bioarkivert, FF-mus, humant og ikke-humant primatlevervev ved bruk av en svært liten mengde startprøvemateriale ved å implementere kjerneekstraksjonsprotokollen som presenteres her. Dette uvurderlige verktøyet vil gi leverbiologer mulighet til å forhøre både genuttrykk og kromatintilgjengelighet i sammenheng med ulike leverpatologier. I tillegg kan ulike nivåer av hepatocytt ploidi og den resulterende justeringen av genuttrykk avhengig av deres plassering i leveren lobule avsløre deres rolle i leveren patologier. Derfor forventer vi at undersøkelsen av cellulær heterogenitet vil gi nye muligheter for utvikling av presisjonsmedisin og målrettede tiltak mot sykdommer som HCC og NAFLD.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av Helmholtz Pioneer Campus (MS, KY, CPM-J.) og Institutt for beregningsbiologi (CT-L.). Denne forskningen ble også støttet av AMED under Grant Number JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). Vi takker Core Genomics ved HMGU (I. de la Rosa) og Bioinformatikk (T. Walzthoeni) støtte, spesielt Xavier Pastor for opplæring og veiledning. Vi takker A. Feuchtinger, U. Buchholz, J. Bushe og alle andre ansatte fra HMGU Pathology and Tissue Analytic kjernefasiliteten for deres tekniske og vitenskapelige støtte, samt J. Zorn, R. Erdelen, D. Würzinger, ansatte i E-Streifen, samt Laboratory Animal Services kjernefasilitet for deres pågående vitenskapelige støtte og diskusjon. Vi er takknemlige for kjernefasilitetscelleanalysen ved TranslaTUM (R. Mishra), og Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Vi takker Dr. I Deligiannis for hans tekniske støtte. Dr. M. Hartman, Dr. A. Schröder og Ms A. Barden (Helmholtz Pioneer Campus) var grunnleggende for deres juridiske, ledelsesmessige og administrative støtte.
10% Tween 20 – 5 mL | Bio-Rad | 1662404 | |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
Adhesive PCR film | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis | Agilent | 5067-4626 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | |
Cell Sorter | For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. | ||
Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000619 | Use chilled at 4 °C |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | 1000127 | |
Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions | 10X Genomics | 1000230 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reactions | 10X Genomics | 1000269 | |
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions | 10X Genomics | 1000285 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
Dithiothreitol (DTT) 1 M solution | Sigma Aldrich | 646563 | Make 1 mM stock solution and use at 1 µM final concentration. |
DNA AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 10223471 | Wipe surfaces and pipettes before start of experiment |
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 16628742 | |
DNA LoBind Tubes, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 16638742 | |
Elution Buffer (EB) – 250 mL | Qiagen | 19086 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 13527550 | |
Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock | Thermo Fisher Scientific | 13518470 | |
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade – 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 10517694 | |
Filters 50 µm, sterile | SYSMEX PARTEC – CELLTRICS | 04-004-2327 | Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) – 1 L | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-Rad | HSP3905 | |
Herenz Heinz ABS Forceps | Thermo Fisher Scientific | 1131884 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Invitrogen | H3570 | Light-sensitive |
Imaging Flow Cytometer | For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream | ||
Invitrogen TE Buffer – 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 11568846 | |
KCl (2 M), RNase-free, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
MgCl2 (1 M), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips | Thermo Fisher Scientific | 10209104 | |
MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips | Thermo Fisher Scientific | 10733087 | |
Mörser 2 mL DOUNCE | Wagner & Munz GmbH | 9651632 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012 | Benchmark Scientific | C1012 | Or any other strip and tube mini centrifuge |
Neubauer Hemocytometer | OMNILAB LABORZENTRUM | 5435293 | Visualize and count nuclei under microscope |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556 | |
Pipette tips RT LTS 1000 µL, Wide-O | Mettler Toledo | 30389218 | |
Pistill "A" 2 mL | Wagner & Munz GmbH | 9651621 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
Pistill "B" 2 mL | Wagner & Munz GmbH | 9651627 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | 10579691 | |
Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 10634141 | |
Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes | Thermo Fisher Scientific | 10100151 | |
Protector RNase inhibitor – 2,000 U | Sigma Aldrich | 3335399001 | Keep in -20 °C until use |
Protein-based RNase Inhibitor SUPERase•In (20 U/μL) | Thermo Fisher Scientific | AM2696 | Keep in -20 °C until use |
Recombinant RNase Inhibitor | Clontech Takara | 2313B | Keep in -20 °C until use |
RNAse free microfuge tubes – 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | Wipe surfaces and pipettes before start of experiment |
SPRIselect – 60 mL | Beckman Coulter | B23318 | Aliquot and store in 4 °C |
Sucrose, 500 g | Sigma Aldrich | S0389-500G | Make a 1 M stock solution |
Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels | Thermo Fisher Scientific | 11798343 | |
Tris-HCI (1M), pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | |
Triton X-100, 98%, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 10671652 | Make 10% stock solution. Keep at 4 °C and protect from light. |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 11538886 | |
Vortex- Mixer | VWR | 444-1372 | Or any other type of vortex |