पॉली-अभिकर्मक के साथ सेल स्टेट आइडेंटिफिकेशन सर्किट का तेजी से विकास
Summary
जटिल आनुवंशिक सर्किट डिजाइन, परीक्षण और अनुकूलन करने के लिए समय लेने वाले हैं। इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए, स्तनधारी कोशिकाओं को एक तरह से स्थानांतरित किया जाता है जो एक ही कुएं में सर्किट घटकों के कई स्टोइकोमेट्री के परीक्षण की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक योजना, अभिकर्मक और डेटा विश्लेषण के लिए चरणों को रेखांकित करता है।
Abstract
स्तनधारी आनुवंशिक सर्किट ने रोग राज्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को समझने और इलाज करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है, लेकिन सर्किट घटकों के स्तर का अनुकूलन चुनौतीपूर्ण और श्रम-गहन बना हुआ है। इस प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने पॉली-अभिकर्मक विकसित किया, जो पारंपरिक स्तनधारी अभिकर्मक का एक उच्च-थ्रूपुट विस्तार है। पॉली-अभिकर्मक में, संक्रमित आबादी में प्रत्येक कोशिका अनिवार्य रूप से एक अलग प्रयोग करती है, विभिन्न डीएनए कॉपी संख्याओं पर सर्किट के व्यवहार का परीक्षण करती है और उपयोगकर्ताओं को एकल-पॉट प्रतिक्रिया में बड़ी संख्या में स्टोइकोमेट्री का विश्लेषण करने की अनुमति देती है। अब तक, पॉली-अभिकर्मक जो कोशिकाओं के एक ही कुएं में तीन-घटक सर्किट के अनुपात को अनुकूलित करते हैं, का प्रदर्शन किया गया है; सिद्धांत रूप में, एक ही विधि का उपयोग बड़े सर्किट के विकास के लिए भी किया जा सकता है। पॉली-अभिकर्मक परिणामों को क्षणिक सर्किट के लिए सह-संक्रमण के लिए डीएनए के इष्टतम अनुपात को खोजने या स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए सर्किट घटकों के लिए अभिव्यक्ति स्तर चुनने के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है।
यहां, हम तीन-घटक सर्किट को अनुकूलित करने के लिए पॉली-अभिकर्मक के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक डिजाइन सिद्धांतों से शुरू होता है और बताता है कि पॉली-अभिकर्मक पारंपरिक सह-अभिकर्मक विधियों पर कैसे बनता है। इसके बाद, कोशिकाओं का पॉली-अभिकर्मक किया जाता है और उसके बाद कुछ दिनों बाद फ्लो साइटोमेट्री की जाती है। अंत में, डेटा का विश्लेषण एकल-सेल फ्लो साइटोमेट्री डेटा के स्लाइस की जांच करके किया जाता है जो कुछ घटक अनुपात वाले कोशिकाओं के उप-समूहों के अनुरूप होते हैं। प्रयोगशाला में, पॉली-अभिकर्मक का उपयोग सेल क्लासिफायर, प्रतिक्रिया और फीडफॉरवर्ड नियंत्रकों, द्विस्थिर रूपांकनों और कई और अधिक को अनुकूलित करने के लिए किया गया है। यह सरल लेकिन शक्तिशाली विधि स्तनधारी कोशिकाओं में जटिल आनुवंशिक सर्किट के लिए डिजाइन चक्रों को गति देती है।
Introduction
स्तनधारी सिंथेटिक जीव विज्ञान के क्षेत्र ने तेजी से प्रगति की है, सुसंस्कृत सेल लाइनों में सरल अर्थ-और-प्रतिक्रिया भागों को विकसित करने से लेकर निदान और चिकित्सीय1 में वास्तविक दुनिया की चुनौतियों का समाधान करने के लिए जीन के जटिल नेटवर्क के अनुकूलन तक। ये परिष्कृत सर्किट माइक्रोआरएनए प्रोफाइल से साइटोकिन्स से छोटे अणु दवाओं तक जैविक इनपुट को महसूस करने और ट्रांजिस्टर, बैंड-पास फिल्टर, टॉगल स्विच और ऑसिलेटर सहित लॉजिक प्रोसेसिंग सर्किट को लागू करने में सक्षम हैं। उन्होंने कैंसर, गठिया, मधुमेह और कई अन्य 1,2,3,4,5 जैसी बीमारियों के पशु मॉडल में भी आशाजनक परिणाम दिखाए हैं। हालांकि, जैसे-जैसे सर्किट की जटिलता बढ़ती है, इसके प्रत्येक घटक के स्तर को अनुकूलित करना तेजी से चुनौतीपूर्ण हो जाता है।
आनुवंशिक सर्किट का एक विशेष रूप से उपयोगी प्रकार एक सेल क्लासिफायर है, जिसे सेलुलर राज्यों को समझने और प्रतिक्रिया देने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है। विशिष्ट सेलुलर राज्यों में प्रोटीन या आरएनए आउटपुट का चयनात्मक उत्पादन कोशिकाओं और ऑर्गेनोइड्स के भेदभाव को निर्देशित और प्रोग्राम करने, रोगग्रस्त कोशिकाओं और / या अवांछनीय सेल प्रकारों की पहचान करने और नष्ट करने औरचिकित्सीय कोशिकाओं के कार्य को विनियमित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।. हालांकि, स्तनधारी कोशिकाओं में सर्किट बनाना जो कई सेलुलर आरएनए और / या प्रोटीन प्रजातियों से सेल राज्यों को सटीक रूप से वर्गीकृत कर सकता है, अत्यधिक चुनौतीपूर्ण रहा है।
सेल वर्गीकरण सर्किट विकसित करने के सबसे अधिक समय लेने वाले चरणों में से एक सर्किट के भीतर व्यक्तिगत घटक जीन, जैसे सेंसर और प्रसंस्करण कारकों के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तरों को अनुकूलित करना है। सर्किट अनुकूलन को गति देने और अधिक परिष्कृत सर्किट के निर्माण की अनुमति देने के लिए, हाल के काम ने इष्टतम रचनाओं और टोपोलॉजी 6,7 की भविष्यवाणी करने के लिए सेल क्लासिफायर सर्किट और उनके घटकों के गणितीय मॉडलिंग का उपयोग किया है। हालांकि इसने अब तक शक्तिशाली परिणाम दिखाए हैं, गणितीय विश्लेषण सर्किट में घटक जीन के इनपुट-आउटपुट व्यवहार को व्यवस्थित रूप से चिह्नित करने की आवश्यकता से सीमित है, जो समय लेने वाला है। इसके अलावा, जटिल आनुवंशिक सर्किट में संदर्भ-निर्भर समस्याओं के असंख्य उभर सकते हैं, जिससे एक पूर्ण सर्किट का व्यवहार व्यक्तिगत भाग लक्षण वर्णन 8,9 के आधार पर भविष्यवाणियों की अवहेलना करता है।
सेल स्टेट क्लासिफायर जैसे जटिल स्तनधारी सर्किट को अधिक तेजी से विकसित करने और परीक्षण करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने पॉली-अभिकर्मक10 नामक एक तकनीक विकसित की, जो प्लास्मिड सह-अभिकर्मक प्रोटोकॉल का एक विकास है। सह-अभिकर्मक में, कई प्लास्मिड डीएनए प्रजातियों को सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए लिपिड या बहुलक अभिकर्मक के साथ मिलकर जटिल किया जाता है, फिर सहसंबद्ध तरीके से कोशिकाओं को दिया जाता है (चित्रा 1 ए)। पॉली-अभिकर्मक में, प्लास्मिड को अभिकर्मक के साथ अलग से जटिल किया जाता है, जैसे कि प्रत्येक अभिकर्मक परिसर से डीएनए को एक गैर-सहसंबद्ध तरीके से कोशिकाओं तक पहुंचाया जाता है (चित्रा 1 बी)। इस विधि का उपयोग करके, संक्रमित आबादी के भीतर कोशिकाओं को विभिन्न सर्किट घटकों को ले जाने वाले दो या दो से अधिक डीएनए पेलोड के अनुपात के कई संयोजनों के संपर्क में लाया जाता है।
प्रत्येक सेल को दिए गए सर्किट घटकों के अनुपात को मापने के लिए, पॉली-अभिकर्मक के भीतर प्रत्येक अभिकर्मक परिसर में एक संवैधानिक रूप से व्यक्त फ्लोरोसेंट रिपोर्टर होता है जो कॉम्प्लेक्स के सेलुलर उत्थान के लिए प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है। फिलर डीएनए जिसमें स्तनधारी कोशिका के भीतर सक्रिय कोई तत्व नहीं होता है, का उपयोग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और सर्किट घटकों की सापेक्ष मात्रा को एक एकल अभिकर्मक परिसर में एक सेल में वितरित करने के लिए किया जाता है और चर्चा में अधिक विस्तार से चर्चा की जाती है। वीस लैब में उपयोग किए जाने वाले फिलर डीएनए का एक उदाहरण एक प्लास्मिड है जिसमें टर्मिनेटर अनुक्रम होता है, लेकिन कोई प्रोमोटर, कोडिंग अनुक्रम आदि नहीं होता है। सर्किट घटकों के विभिन्न अनुपातों वाली कोशिकाओं की तुलना जीन सर्किट फ़ंक्शन के लिए इष्टतम अनुपात खोजने के लिए की जा सकती है। यह बदले में आनुवंशिक एकीकरण के लिए सर्किट घटकों को एकल वेक्टर में संयोजित करते समय इष्टतम जीन अभिव्यक्ति स्तर प्राप्त करने के लिए प्रमोटरों और अन्य सर्किट तत्वों को चुनने के लिए उपयोगी भविष्यवाणियां देता है (जैसे, एक लेंटिवायरस, ट्रांसपोसन, या लैंडिंग पैड)। इस प्रकार, अंतर्ज्ञान के आधार पर या समय लेने वाले परीक्षण और त्रुटि प्रक्रिया के माध्यम से सर्किट घटकों के बीच अनुपात चुनने के बजाय, पॉली-अभिकर्मक एकल-पॉट प्रतिक्रिया में आनुवंशिक भागों के बीच स्टोइकोमेट्री की एक विस्तृत श्रृंखला का मूल्यांकन करता है।
हमारी प्रयोगशाला में, पॉली-अभिकर्मक ने कई आनुवंशिक सर्किटों के अनुकूलन को सक्षम किया है, जिसमें सेल क्लासिफायर, फीडबैक और फीडफॉरवर्ड नियंत्रक और द्विस्थिर रूपांकन शामिल हैं। यह सरल लेकिन शक्तिशाली विधि स्तनधारी कोशिकाओं में जटिल आनुवंशिक सर्किट के लिए डिजाइन चक्रों को काफी गति देती है। पॉली-अभिकर्मक का उपयोग तब से कई आनुवंशिक सर्किटों को चिह्नित करने के लिए किया गया है ताकि उच्च रिज़ॉल्यूशन10 पर उनके बहु-आयामी इनपुट-आउटपुट ट्रांसफर फ़ंक्शंस को प्रकट किया जा सके, सेल स्टेट वर्गीकरण 11 के लिए एक वैकल्पिक सर्किट टोपोलॉजी का अनुकूलन किया जा सके, और विभिन्न प्रकाशित 12,13 और चल रही परियोजनाओं में तेजी लाई जा सके।
यहां हम आनुवंशिक सर्किट को तेजी से अनुकूलित करने के लिए पॉली-अभिकर्मक का उपयोग करने के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन और चित्रण करते हैं (चित्रा 2)। प्रोटोकॉल दिखाता है कि उच्च गुणवत्ता वाले पॉली-अभिकर्मक डेटा कैसे उत्पन्न करें और पॉली-अभिकर्मक प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण (चित्रा 3) में कई सामान्य त्रुटियों से बचें। यह तब दर्शाता है कि सरल सर्किट घटकों को चिह्नित करने के लिए पॉली-अभिकर्मक का उपयोग कैसे करें और इस प्रक्रिया में, सह-अभिकर्मक के खिलाफ बेंचमार्क पॉली-अभिकर्मक परिणाम (चित्रा 4)। अंत में, पॉली-अभिकर्मक के परिणाम कैंसर क्लासिफायर सर्किट (चित्रा 5) के अनुकूलन को दिखाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी), ब्रेडबोर्डिंग और 3 डी प्रिंटिंग जैसे रैपिड प्रोटोटाइप विधियों ने मैकेनिकल, इलेक्ट्रिकल और सिविल इंजीनियरिंग विषयों में क्रांति ला दी है। किसी दिए गए चुनौती के कई संभावि?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पूर्व वीस लैब सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने पॉली-अभिकर्मक विधि विकसित करने और सेल क्लासिफायर्स के लिए इसके आवेदन का नेतृत्व या योगदान दिया: जेरेमी गैम, ब्रे डिएंड्रेथ, और जिन हुह; अन्य वीस प्रयोगशाला सदस्य जिन्होंने आगे विधि विकास / अनुकूलन में योगदान दिया है: वेनलोंग जू, लेई वांग, और क्रिश्चियन क्यूबा-समानिगो; जोश लियोनार्ड और पैट्रिक डोनह्यू और हैली एडेलस्टीन सहित समूह के सदस्य, पॉली-अभिकर्मक का परीक्षण करने और प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए; और इस पांडुलिपि को आमंत्रित करने और प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए प्रोफेसर निका शाकिबा। हम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792] को भी धन्यवाद देना चाहते हैं; राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन [1745645]; इस काम के वित्तपोषण के लिए एनसीआई और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ [पी 50जीएम 098792] से कैंसर सेंटर सपोर्ट (कोर) अनुदान [पी 30 सीसीए 14051, भाग में]।
Materials
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
Riferimenti
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