Visualizzazione dei siti di infezione precoce della malattia dell'esplosione del riso (Magnaporthe oryzae) sull'orzo (Hordeum vulgare) utilizzando un microscopio di base e uno smartphone

Summary

Questo è un protocollo semplice di un test di guaina di foglie d’orzo che utilizza reagenti minimi e attrezzature di laboratorio comuni (incluso uno smartphone di base). Lo scopo è quello di visualizzare il processo di infezione precoce della malattia blastica in laboratori senza accesso ad apparecchiature di microscopia avanzate.

Abstract

Capire come le piante e gli agenti patogeni interagiscono e se tale interazione culmina nella difesa o nella malattia, è necessario per sviluppare strategie più forti e più sostenibili per la salute delle piante. I progressi nei metodi che visualizzano in modo più efficace i campioni di patogeni vegetali durante l’infezione e la colonizzazione hanno prodotto strumenti come il saggio della guaina delle foglie di riso, che è stato utile nel monitoraggio dell’infezione e degli eventi di colonizzazione precoce tra il riso e il patogeno fungino, Magnaporthe oryzae. Questo patogeno emi-biotrofico causa gravi perdite di malattia nel riso e nelle monocotiledoni correlate, tra cui miglio, segale, orzo e, più recentemente, grano. Il saggio della guaina fogliare, se eseguito correttamente, produce una sezione vegetale otticamente chiara, spessa diversi strati, che consente ai ricercatori di eseguire l’imaging di cellule vive durante l’attacco di patogeni o generare campioni fissi colorati per caratteristiche specifiche. Indagini cellulari dettagliate sull’interazione orzo-M. oryzae sono rimaste indietro rispetto a quelle dell’ospite del riso, nonostante la crescente importanza di questo grano come fonte di cibo per animali e umani e come bevande fermentate. Qui è riportato lo sviluppo di un saggio di guaina per foglie d’orzo per studi complessi sulle interazioni di M. oryzae durante le prime 48 ore post-inoculazione. Il saggio della guaina fogliare, indipendentemente dalla specie studiata, è delicato; Viene fornito un protocollo che copre tutto, dalle condizioni di crescita dell’orzo e l’ottenimento di una guaina fogliare, all’inoculazione, all’incubazione e all’imaging del patogeno sulle foglie delle piante. Questo protocollo può essere ottimizzato per lo screening ad alta produttività utilizzando qualcosa di semplice come uno smartphone per scopi di imaging.

Introduction

Magnaporthe oryzae, il fungo esplosione del riso, infetta un assortimento di colture di cereali, tra cui orzo, grano e riso¹. Questo agente patogeno causa malattie devastanti e rappresenta una minaccia mondiale per queste preziose colture, causando la perdita completa del raccolto se non controllato. Molti laboratori in tutto il mondo si concentrano sulla malattia dell’esplosione del riso a causa della sua minaccia globale e dei suoi attributi come modello eccellente per le interazioni pianta-fungo². È stato completamente sequenziato e la genetica del suo ciclo infettivo, in particolare gli eventi precoci, è stata stabilita ^3,4. Il ciclo vitale inizia con una spora che germina su una superficie fogliare, formando la struttura di penetrazione specializzata chiamata appressorio. L’appressorio penetra nel tessuto fogliare e l’infezione continua con lo sviluppo di lesioni che iniziano il processo di sporulazione e diffondono la malattia⁴. Prevenire uno qualsiasi di questi eventi precoci inibirebbe drasticamente questa malattia devastante. Di conseguenza, la maggior parte della ricerca attuale sulla malattia blastica si è concentrata sulle prime fasi dell’infezione, dai conidi germinati che formano un appressorio allo sviluppo delle ife invasive e del complesso interfacciale biotrofico (BIC)⁵.

La grande quantità di ricerche sulla malattia blastica è stata condotta nel riso, anche se M. oryzae è un patogeno significativo per una varietà di colture, e ceppi di recente evoluzione stanno emergendo come una minaccia globale per il grano⁶. Mentre il riso è una delle prime tre colture di base utilizzate per nutrire la popolazione, insieme a grano e mais, l’orzo è il quarto cereale in termini di alimentazione per il bestiame e produzione di birra⁷. Con la crescita dell’industria della birra artigianale, cresce anche il valore economico dell’orzo. Ci sono diversi vantaggi nell’utilizzare M. oryzae e orzo come patosistema per studiare la malattia blastica. In primo luogo, ci sono ceppi di M. oryzae che infettano solo l’orzo, così come ceppi che possono infettare più specie di erba. Ad esempio, 4091-5-8 infetta principalmente solo l’orzo, mentre Guy11 e 70-15 possono infettare sia l’orzo che il riso⁸. Questi ceppi sono geneticamente simili e il processo di infezione è paragonabile⁹. In secondo luogo, in condizioni standard di laboratorio e di serra, l’orzo è più facile da coltivare, in quanto non ha i complicati requisiti del riso (controllo conciso della temperatura, alta umidità, spettri di luce specifici). Ci sono anche sfide di imaging con il riso a causa dell’idrofobicità della superficie fogliare, che l’orzo non mostra¹⁰.

Questo protocollo presenta un metodo semplice per isolare e utilizzare efficacemente guaine per foglie d’orzo per l’analisi microscopica di più stadi di infezione, utilizzando comuni forniture di laboratorio e uno smartphone per la raccolta dei dati. Questo metodo per il test della guaina delle foglie d’orzo è adattabile per i laboratori di tutto il mondo in quanto richiede forniture minime e tuttavia fornisce un quadro chiaro dell’interazione microscopica tra l’agente patogeno e le prime cellule che infetta. Mentre i saggi di patogenicità, come l’inoculazione di spray o goccioline, possono fornire una visione macro della capacità del patogeno di formare lesioni, questo test consente al ricercatore di visualizzare fasi specifiche dell’infezione precoce, dagli eventi di pre-penetrazione alla colonizzazione delle cellule epidermiche. Inoltre, i ricercatori possono facilmente confrontare l’infezione con il fungo di tipo selvatico con l’infezione con un mutante ridotto in virulenza.

Protocol

1. Preparazione di materiali sperimentali Preparare l’agar di farina d’avena (OMA) mescolando la farina d’avena fino a quando non è una polvere fine. Aggiungere 25 g di farina d’avena in polvere e 15 g di agar a 500 mL di ddH2O e sterilizzare in autoclave sul ciclo di supporto (in alternativa portare a ebollizione per 20 minuti). Versare il supporto in piastre di Petri sterili da 60 mm.NOTA: altri tipi di supporti che inducono la sporulazione, come l’agar V8, sono accettabili pe…

Representative Results

Una rappresentazione del flusso di lavoro iniziale per questa tecnica è illustrata nella Figura 1. Le guaine sono state raccolte da piante d’orzo “Lacey” sensibili di 14 giorni (H. vulgare). I conidi sono stati raccolti da piastre sporulanti di M. oryzae OMA di 10 giorni, con una sospensione condiale preparata utilizzandoddH 2O sterile per una concentrazione finale di 5 x 104 spore per ml. La sospensione dell’inoculo è stata applicata direttamente al…

Discussion

Ci sono molti saggi comunemente usati disponibili per testare i ceppi di M. oryzae che forniscono una visione a livello macroscopico di una risposta infettiva compatibile o incompatibile, come le inoculazioni di spray o goccioline, e l’uso di sistemi di valutazione per quantificare le dimensioni delle lesioni^13,14. Un altro test comune per M. oryzae è quello di testare la capacità del patogeno di formare la sua struttura di penetrazione specia…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Cell phone	Google	Pixel 4A	Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.
Cell phone Microscope adapter	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microscope	AmScope	FM690TC	40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
Oatmeal old fashioned rolled oats	Quaker	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
Rectangular coverglass	Corning	CLS2975245
Slides, microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Stage micrometer	OMAX	A36CALM7	0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146