Visualizzazione dei siti di infezione precoce della malattia dell'esplosione del riso (Magnaporthe oryzae) sull'orzo (Hordeum vulgare) utilizzando un microscopio di base e uno smartphone

Sommario

Questo è un protocollo semplice di un test di guaina di foglie d'orzo che utilizza reagenti minimi e attrezzature di laboratorio comuni (incluso uno smartphone di base). Lo scopo è quello di visualizzare il processo di infezione precoce della malattia blastica in laboratori senza accesso ad apparecchiature di microscopia avanzate.

Abstract

Capire come le piante e gli agenti patogeni interagiscono e se tale interazione culmina nella difesa o nella malattia, è necessario per sviluppare strategie più forti e più sostenibili per la salute delle piante. I progressi nei metodi che visualizzano in modo più efficace i campioni di patogeni vegetali durante l'infezione e la colonizzazione hanno prodotto strumenti come il saggio della guaina delle foglie di riso, che è stato utile nel monitoraggio dell'infezione e degli eventi di colonizzazione precoce tra il riso e il patogeno fungino, Magnaporthe oryzae. Questo patogeno emi-biotrofico causa gravi perdite di malattia nel riso e nelle monocotiledoni correlate, tra cui miglio, segale, orzo e, più recentemente, grano. Il saggio della guaina fogliare, se eseguito correttamente, produce una sezione vegetale otticamente chiara, spessa diversi strati, che consente ai ricercatori di eseguire l'imaging di cellule vive durante l'attacco di patogeni o generare campioni fissi colorati per caratteristiche specifiche. Indagini cellulari dettagliate sull'interazione orzo-M. oryzae sono rimaste indietro rispetto a quelle dell'ospite del riso, nonostante la crescente importanza di questo grano come fonte di cibo per animali e umani e come bevande fermentate. Qui è riportato lo sviluppo di un saggio di guaina per foglie d'orzo per studi complessi sulle interazioni di M. oryzae durante le prime 48 ore post-inoculazione. Il saggio della guaina fogliare, indipendentemente dalla specie studiata, è delicato; Viene fornito un protocollo che copre tutto, dalle condizioni di crescita dell'orzo e l'ottenimento di una guaina fogliare, all'inoculazione, all'incubazione e all'imaging del patogeno sulle foglie delle piante. Questo protocollo può essere ottimizzato per lo screening ad alta produttività utilizzando qualcosa di semplice come uno smartphone per scopi di imaging.

Introduzione

Magnaporthe oryzae, il fungo esplosione del riso, infetta un assortimento di colture di cereali, tra cui orzo, grano e riso¹. Questo agente patogeno causa malattie devastanti e rappresenta una minaccia mondiale per queste preziose colture, causando la perdita completa del raccolto se non controllato. Molti laboratori in tutto il mondo si concentrano sulla malattia dell'esplosione del riso a causa della sua minaccia globale e dei suoi attributi come modello eccellente per le interazioni pianta-fungo². È stato completamente sequenziato e la genetica del suo ciclo infettivo, in particolare gli eventi precoci, è sta....

Protocollo

1. Preparazione di materiali sperimentali

1. Preparare l'agar di farina d'avena (OMA) mescolando la farina d'avena fino a quando non è una polvere fine. Aggiungere 25 g di farina d'avena in polvere e 15 g di agar a 500 mL di ddH₂O e sterilizzare in autoclave sul ciclo di supporto (in alternativa portare a ebollizione per 20 minuti). Versare il supporto in piastre di Petri sterili da 60 mm.
   NOTA: altri tipi di supporti che inducono la sporulazione, come l'agar V8, sono accettabili per questo protocollo.
2. La piastra M. oryzae filtra direttamente sulle piastre OMA utilizzando una pinza sterile, e consente loro di co....

Risultati

Una rappresentazione del flusso di lavoro iniziale per questa tecnica è illustrata nella Figura 1. Le guaine sono state raccolte da piante d'orzo "Lacey" sensibili di 14 giorni (H. vulgare). I conidi sono stati raccolti da piastre sporulanti di M. oryzae OMA di 10 giorni, con una sospensione condiale preparata utilizzando_{ddH 2}O sterile per una concentrazione finale di 5 x 10⁴ spore per ml. La sospensione dell'inoculo è stata applicata direttamente alle.......

Discussione

Ci sono molti saggi comunemente usati disponibili per testare i ceppi di M. oryzae che forniscono una visione a livello macroscopico di una risposta infettiva compatibile o incompatibile, come le inoculazioni di spray o goccioline, e l'uso di sistemi di valutazione per quantificare le dimensioni delle lesioni^13,14. Un altro test comune per M. oryzae è quello di testare la capacità del patogeno di formare la sua struttura di penetrazione speciali.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido acetico	Sigma-Aldrich	A6283
Telefono cellulare	Google	Pixel 4A	Qualsiasi smartphone con una fotocamera posteriore che può essere montata in un supporto sarà sufficiente.
Adattatore per microscopio per telefono cellulare	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63& sr=8-2 -spons& psc=1& spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G5516
Microscopio	AmScope	FM690TC	40x– 2500x Microscopio trinoculare verticale a epifluorescenza
Fiocchi d'avena vecchio stile Fiocchi d'avena	Quaker	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 & hvadid=312253390021& hvpos= & hvnetw=g& hvrand=98212627704 6839544& hvpone=& HVPTWO=& hvq mt=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9007494& HVTARGID =PLA-568492637928& psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
CLS2975245		Corning	rettangolari in vetro
, microscopio	Sigma-Aldrich	S8902
Micrometro da tavolino	OMAX	A36CALM7	0,1 mm e 0,01 mm Vetrino di calibrazione per microscopio
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146

Vetrini da copertura