JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Medicina

Spændingsafhængig kaliumstrømsoptagelse på H9c2-kardiomyocytter via helcelle-patch-klemme-teknikken

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
, , , , , , ,
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Den nuværende protokol beskriver en effektiv metode til realtid og dynamisk erhvervelse af spændingsstyrede kalium (Kv) kanalstrømme i H9c2 kardiomyocytter ved hjælp af helcelle patch-clamp-teknikken.

Abstract

Kaliumkanaler på myokardiecellemembranen spiller en vigtig rolle i reguleringen af celleelektrofysiologiske aktiviteter. At være en af de vigtigste ionkanaler, spændingsstyrede kaliumkanaler (Kv) er tæt forbundet med nogle alvorlige hjertesygdomme, såsom lægemiddelinduceret myokardieskade og myokardieinfarkt. I denne undersøgelse blev helcelle-patch-clamp-teknikken anvendt til at bestemme virkningerne af 1,5 mM 4-aminopyridin (4-AP, en bredspektret kaliumkanalhæmmer) og aconitin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM og 200 μM) på Kv-kanalstrømmen (IKv) i H9c2-kardiomyocytter. Det blev konstateret, at 4-AP hæmmede I Kv med ca. 54%, mens den hæmmende virkning af AC på IKv viste en dosisafhængig tendens (ingen effekt for 25 μM, 30% hæmningshastighed for 50 μM, 46% hæmmende sats for 100 μM og 54% hæmmende sats for 200 μM). På grund af egenskaberne ved højere følsomhed og præcision vil denne teknik fremme udforskningen af kardiotoksicitet og de farmakologiske virkninger af etnomedicin rettet mod ionkanaler.

Introduction

Ionkanaler er specielle integrerede proteiner indlejret i lipiddobbeltlaget i cellemembranen. I nærværelse af aktivatorer danner centrene for sådanne specielle integrerede proteiner meget selektive hydrofile porer, hvilket tillader ioner af en passende størrelse og ladning at passere igennem på en passiv transportmåde1. Ionkanaler er grundlaget for celle excitabilitet og bioelektricitet og spiller en nøglerolle i en række cellulære aktiviteter2. Hjertet leverer blod til andre organer gennem regelmæssige sammentrækninger som følge af en excitation-kontraktion-koblet proces initieret af handlingspotentialer3. Tidligere undersøgelser har bekræftet, at dannelsen af handlingspotentialer i kardiomyocytter er forårsaget af ændringen i intracellulær ionkoncentration, og aktivering og inaktivering af Na +, Ca2+ og K + ionkanaler i humane kardiomyocytter fører til dannelse af handlingspotentialer i en bestemt sekvens 4,5,6. Forstyrrede spændingsstyrede kaliumkanalstrømme (Kv) (IKv) kan ændre den normale hjerterytme, hvilket fører til arytmier, som er en af de førende dødsårsager. Derfor er optagelse af IKv afgørende for at forstå mekanismerne i lægemidler til behandling af livstruende arytmier7.

Kv-kanalen er en vigtig bestanddel af kaliumkanalen. Kv-kanalens koordinationsfunktion spiller en vigtig rolle i pattedyrshjertets elektriske aktivitet og myokardiekontraktilitet 8,9,10. I kardiomyocytter afhænger amplituden og varigheden af handlingspotentialer af co-ledningen af udadgående K + strømme af flere Kv-kanalundertyper11. Reguleringen af Kv-kanalfunktionen er meget vigtig for den normale repolarisering af hjertehandlingspotentialet. Selv den mindste ændring i Kv-konduktans påvirker i høj grad hjerterepolarisering og øger muligheden for arytmi12,13.

Som en grundlæggende metode i cellulær elektrofysiologisk forskning kan en tætning med høj modstand mellem et lille område af cellemembranen og en pipettespids til optagelse af helcelleplaster etableres ved at anvende et undertryk. Det kontinuerlige undertryk får cellemembranen til at komme i kontakt med pipettespidsen og klæbe fast på pipettens indre væg. Det resulterende komplette elektriske kredsløb gør det muligt at registrere en hvilken som helst enkelt ionkanalstrøm over overfladen af cellemembranen14. Denne teknik har en meget høj følsomhed for cellemembranens ionkanalstrøm og kan bruges til at detektere strømme i alle ionkanaler, og applikationerne er ekstremt brede15. Desuden har patch-clamp højere autoritet og nøjagtighed16 sammenlignet med fluorescerende mærkning og radioaktiv mærkning. På nuværende tidspunkt er helcelle-patch-clamp-teknikken blevet brugt til at detektere de traditionelle kinesiske medicinkomponenter, der virker på Kv-kanalstrømme17,18,19. For eksempel brugte Wang et al. helcelle-patch-klemme-teknikken og bekræftede, at den effektive komponent i lotusfrøet kunne opnå hæmning af Kv4.3-kanalen ved at blokere de aktiverede tilstandskanaler19. Aconitin (AC) er en af de effektive og aktive ingredienser i Aconitum arter, såsom Aconitum carmichaeli Debx og Aconitum pendul Busch. Talrige undersøgelser har vist, at overdoser af AC kan forårsage arytmier og endda hjertestop20. Samspillet mellem AC og spændingsstyrede ionkanaler fører til forstyrrelse af intracellulær ionhomeostase, som er nøglemekanismen for kardiotoksicitet21. Derfor anvendes helcelleplaster-klemme-teknikken i denne undersøgelse til at bestemme virkningerne af AC på IKv af kardiomyocytter.

Protocol

De kommercielt opnåede H9c2 rotte kardiomyocytter (se materialetabellen) blev inkuberet i DMEM indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovin serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet atmosfære. Helcelle-patch-clamp-teknikken blev derefter anvendt til at detektere ændringerne i IKv i normale H9c2-celler og 4-AP- eller AC-behandlede celler (figur 1 og figur 2). <…

Representative Results

Denne protokol tillod optagelse af IKv i henhold til parametrene i helcelle patch-clamp-teknikken. IKv blev udløst af 150 ms depolariserende pulsstimulering fra -40 til +60 mV ved et holdepotentiale på -60 mV (figur 3A). IKv af H9c2 rotte kardiomyocytter dukkede først op omkring -20 mV, og derefter steg amplituden med yderligere depolarisering. Det gennemsnitlige forhold mellem IKv og membranpotentialet blev beregnet ud fra de målte strømampli…

Discussion

Den elektrofysiologiske teknik med patch-clamp bruges hovedsageligt til at registrere og reflektere den elektriske aktivitet og funktionelle egenskaber ved ionkanaler på cellemembranen25. På nuværende tidspunkt inkluderer de vigtigste optagelsesmetoder for patch-clamp-teknikken enkeltkanalsoptagelse og helcelleoptagelse26. Til helcelletilstand bruges glasmikroelektroden og undertrykket til at danne en højmodstandsforsegling mellem et lille område af cellemembranen og e…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi sætter pris på den økonomiske støtte fra National Natural Science Foundation of China (82130113) og Key F &D and Transformation Program fra Science & Technology Department of Qinghai Province (2020-SF-C33).

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
  3. Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
  4. Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
  5. Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
  6. Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
  8. Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
  9. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  10. Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
  11. Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
  12. Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
  13. Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 42-46 (2007).
  14. Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
  15. Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
  16. Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
  17. Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
  18. Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
  19. Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
  20. Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
  21. Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
  22. An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
  23. Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
  24. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
  25. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
  26. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  27. Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
  28. Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
  29. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  30. Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
  31. Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
  32. Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
  33. Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  34. Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
  35. Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
  36. Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , (2007).
  37. Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
  38. Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
  39. Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
  40. Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).

Tags

Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
check_url/it/64805?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image