Исследование защитных эффектов платикодина D на неалкогольную жировую болезнь печени в модели, индуцированной пальмитиновой кислотой in vitro

Summary

В этом протоколе исследуются защитные эффекты платикодина D на неалкогольную жировую болезнь печени в модели, индуцированной пальмитиновой кислотой in vitro .

Abstract

Заболеваемость неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП) растет с угрожающей скоростью во всем мире. Platycodon grandiflorum широко используется в качестве традиционной этномедицины для лечения различных заболеваний и является типичной функциональной пищей, которая может быть включена в повседневный рацион. Исследования показали, что платикодин D (PD), один из основных активных ингредиентов Platycodon grandiflorum, обладает высокой биодоступностью и значительно смягчает прогрессирование НАЖБП, но основной механизм этого до сих пор неясен. Это исследование направлено на изучение терапевтического эффекта БП против НАЖБП in vitro. Клетки AML-12 предварительно обрабатывали 300 мкМ пальмитиновой кислотой (ПА) в течение 24 ч для моделирования НАЖБП in vitro. Затем клетки либо обрабатывали БП, либо не получали лечения БП в течение 24 часов. Уровни активных форм кислорода (АФК) анализировали с помощью окрашивания 2′,7′-дихлордигидро-флуоресцеинового диацетата (DCFH-DA), а мембранный потенциал митохондрий определяли методом окрашивания JC-1. Кроме того, уровни экспрессии белков LC3-II/LC3-I и p62/SQSTM1 в лизатах клеток анализировали методом вестерн-блоттинга. Было обнаружено, что БП значительно снижает уровни АФК и митохондриального мембранного потенциала в группе, получавшей ПА, по сравнению с контрольной группой. Между тем, БП повышала уровни LC3-II/LC3-I и снижала уровни p62/SQSTM1 в группе, получавшей PA, по сравнению с контрольной группой. Результаты показали, что БП улучшает НАЖБП in vitro , уменьшая окислительный стресс и стимулируя аутофагию. Эта модель in vitro является полезным инструментом для изучения роли БП в НАЖБП.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), который является высушенным корнем Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., используется в традиционной китайской медицине (ТКМ). Он в основном производится в северо-восточных, северных, восточных, центральных и юго-западных регионах Китая¹. Компоненты PG включают тритерпеноидные сапонины, полисахариды, флавоноиды, полифенолы, полиэтиленгликоли, летучие масла и минералы². PG имеет долгую историю использования в качестве пищи и растительного лекарственного средства в Азии. Традиционно эта трава использовалась для изготовления лекарств от болезней легких. Современная фармакология также предоставляет доказательства эффективности ПГ для лечения других заболеваний. Исследования показали, что ПГ оказывает терапевтическое действие на различные модели лекарственно-индуцированного повреждения печени. Пищевые добавки PG или экстрактов платикодина могут улучшить ожирение, вызванное диетой с высоким содержанием жиров, и связанные с ним метаболические заболевания ^3,4,5. Полисахариды из PG можно использовать для лечения острого повреждения печени, вызванного LPS / D-GalN у мышей⁶. Кроме того, сапонины из корней PG улучшают вызванный диетой неалкогольный стеатогепатит (НАСГ)⁷. Кроме того, платикодин D (PD), один из наиболее важных терапевтических компонентов PG, может усиливать экспрессию рецепторов липопротеинов низкой плотности и поглощение липопротеинов низкой плотности в клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2)⁸. Кроме того, БП может также индуцировать апоптоз и ингибировать адгезию, миграцию и инвазию в клетках HepG2 ^9,10. Таким образом, в данном исследовании клетки AML-12 гепатомы мыши используются для построения модели in vitro и для дальнейшего изучения фармакологических эффектов и основных механизмов БП в этой модели.

Термин неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) относится к группе заболеваний печени, которая включает простой стеатоз, НАСГ, цирроз и гепатоцеллюлярную карциному¹¹. Хотя патогенез НАЖБП до конца не изучен, от классической теории «двух ударов» до современной теории «множественного удара» резистентность к инсулину считается центральной в патогенезе НАЖБП^12,13,14. Исследования показали, что резистентность к инсулину в гепатоцитах может привести к увеличению количества свободных жирных кислот, которые образуют триглицериды, которые откладываются в печени и заставляют печень становиться жирной^15,16. Накопление жира может привести к липотоксичности, митохондриальной дисфункции, вызванной окислительным стрессом, стрессу эндоплазматического ретикулума и высвобождению воспалительных цитокинов, что приводит к патогенезу и прогрессированию НАЖБП^17,18. Кроме того, аутофагия также играет роль в патогенезе НАЖБП, поскольку она участвует в регуляции клеточной чувствительности к инсулину, клеточном липидном обмене, повреждении гепатоцитов и врожденном иммунитете 19,20,21.

Было создано множество животных моделей и клеточных моделей, чтобы обеспечить основу для изучения патогенеза и потенциальных терапевтических мишеней НАЖБП^22,23. Однако модели на отдельных животных не могут полностью имитировать все патологические процессы НАЖБП²⁴. Индивидуальные различия между животными приводят к разным патологическим особенностям. Использование клеточных линий печени или первичных гепатоцитов в исследованиях НАЖБП in vitro обеспечивает максимальную согласованность в экспериментальных условиях. Нарушение регуляции липидного обмена в печени может привести к более высоким уровням накопления липидных капель гепатоцитов в НАЖБП²⁵. Свободные жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и пальмовое масло, использовались в модели in vitro для имитации НАЖБП, вызванной диетой с высоким содержанием жиров^26,27. Клеточная линия гепатобластомы человека HepG2 часто используется при построении моделей НАЖБП in vitro, но, как линия опухолевых клеток, метаболизм клеток HepG2 значительно отличается от метаболизма клеток печени в нормальных физиологических условиях²⁸. Таким образом, использование первичных гепатоцитов или первичных гепатоцитов мыши для построения модели НАЖБП in vitro для скрининга лекарств является более выгодным, чем использование линий опухолевых клеток. Сравнивая синергетическое исследование эффектов лекарств и терапевтических мишеней как на животных моделях, так и на моделях гепатоцитов in vitro, представляется, что использование гепатоцитов мыши для построения модели НАЖБП in vitro имеет лучший потенциал применения.

Свободные жирные кислоты, поступающие в печень, окисляются для производства энергии или хранятся в виде триглицеридов. Важно отметить, что свободные жирные кислоты обладают определенной липотоксичностью и могут вызывать клеточную дисфункцию и апоптоз¹². Пальмитиновая кислота (ПА) является наиболее распространенной насыщенной жирной кислотой в плазме крови^{человека 29}. Когда клетки в нежировой ткани подвергаются воздействию высоких концентраций ПА в течение длительного времени, это стимулирует выработку активных форм кислорода (АФК) и вызывает окислительный стресс, накопление липидов и даже апоптоз³⁰. Поэтому многие исследователи используют ПА в качестве индуктора для стимуляции клеток печени к выработке АФК и, таким образом, строят модель жировой болезни печени in vitro и оценивают защитные эффекты определенных активных веществ на клетки^31,32,33,34. В этом исследовании представлен протокол для изучения защитных эффектов БП на клеточной модели НАЖБП, индуцированной ПА.

Protocol

Клетки AML-12 (нормальная клеточная линия гепатоцитов мыши) используются для клеточных исследований. Ячейки получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). 1. Предварительная обработка клеток AML-12 для моделирования НАЖБП in vitro Подд?…

Representative Results

Внутриклеточные АФК в клеткахКлетки ОМЛ-12 индуцировали 300 мкМ ПА в течение 24 ч, и была создана модель клеток НАЖБП. В последующем клетки обрабатывали БП в течение 24 ч. Клетки были помечены флуоресцентным зондом DCFH-DA, а образование АФК наблюдалось под флуоресцентным микроскопо…

Discussion

Исследования подчеркнули тот факт, что НАЖБП является клинико-патологическим синдромом, варьирующимся от жировой дистрофии печени до НАСГ, который может прогрессировать до цирроза и рака печени⁵¹. Диета с высоким содержанием жиров и малоподвижный образ жизни являются тип?…

Materials

5% BSA Blocking Buffer	Solarbio, Beijing, China	SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line	Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China	AML12
Beyo ECL Plus	Beyotime, Shanghai, China	P0018S
Bio-safety cabinet	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	AC2-5S1 A2
cellSens	Olympus, Tokyo, Japan	1.8
Culture CO2 Incubator	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	CCL-170B-8
Dexamethasone	Beyotime, Shanghai, China	ST125
Dimethyl sulfoxide	Solarbio, Beijing, China	D8371
DMEM/F12	Hyclone, Logan, UT, USA	SH30023.01
Foetal Bovine Serum	Hyclone, Tauranga, New Zealand	SH30406.05
Graphpad software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	ABclonal, Wuhan, China	AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane	Merck, Darmstadt, Germany	IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×	Beyotime, Shanghai, China	C0341
MAP LC3β Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1	Solarbio, Beijing, China	M8650
Olympus Inverted Microscope IX53	Olympus, Tokyo, Japan	IX53
Palmitic Acid	Sigma, Germany	P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	Hyclone, Logan, UT, USA	SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Beyotime, Shanghai, China	ST506
Phosphate Buffered Solution	Hyclone, Logan, UT, USA	BL302A
Platycodin D	Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China	CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x	Beyotime, Shanghai, China	P1005
Protein Marker	Solarbio, Beijing, China	PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit	Solarbio, Beijing, China	CA1410
RIPA Lysis Buffer	Beyotime, Shanghai, China	P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime, Shanghai, China	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Beyotime, Shanghai, China	P0015
Sigma Centrifuge	Sigma, Germany	3K15
SQSTM1/p62 Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO	Tecan Austria GmbH, Austria	1510002987
WB Transfer Buffer,10x	Solarbio, Beijing, China	D1060
β-Actin Mouse mAb	ABclonal, Wuhan, China	AC004