Investigando os Efeitos Protetores da Platicodina D na Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Modelo In Vitro Induzido por Ácido Palmítico

Summary

Este protocolo investiga os efeitos protetores da platicodina-D na doença hepática gordurosa não alcoólica em modelo in vitro induzido por ácido palmítico.

Abstract

A ocorrência da doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) vem aumentando de forma alarmante em todo o mundo. Platycodon grandiflorum é amplamente utilizado como uma etnomedicina tradicional para o tratamento de várias doenças e é um alimento funcional típico que pode ser incorporado na dieta diária. Estudos têm sugerido que a platicodina D (PD), um dos principais ingredientes ativos do Platycodon grandiflorum, tem alta biodisponibilidade e atenua significativamente o progresso da DHGNA, mas o mecanismo subjacente a isso ainda não está claro. Este estudo tem como objetivo investigar in vitro o efeito terapêutico da DP contra a DHGNA. Células AML-12 foram pré-tratadas com ácido palmítico (PA) 300 μM por 24 h para modelo de DHGNA in vitro. Em seguida, as células foram tratadas com DP ou não receberam tratamento de DP por 24 horas. Os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) foram analisados usando a coloração de 2′,7′-dicloro-diidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA), e o potencial de membrana mitocondrial foi determinado pelo método de coloração JC-1. Além disso, os níveis de expressão proteica de LC3-II/LC3-I e p62/SQSTM1 nos lisados celulares foram analisados por western blotting. Descobriu-se que a DP diminuiu significativamente os níveis de ROS e potencial de membrana mitocondrial no grupo tratado com AP em comparação com o grupo controle. Enquanto isso, a DP aumentou os níveis de LC3-II/LC3-I e diminuiu os níveis de p62/SQSTM1 no grupo tratado com AP em comparação com o grupo controle. Os resultados indicaram que a DP melhorou a DHGNA in vitro , reduzindo o estresse oxidativo e estimulando a autofagia. Este modelo in vitro é uma ferramenta útil para estudar o papel da DP na DHGNA.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), que é a raiz seca de Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., é usado na medicina tradicional chinesa (MTC). É produzido principalmente nas regiões nordeste, norte, leste, central e sudoeste da China¹. Os componentes do PG incluem saponinas triterpenóides, polissacarídeos, flavonoides, polifenóis, polietilenoglicóis, óleos voláteis e minerais². PG tem uma longa história de ser usado como um alimento e um fitoterápico na Ásia. Tradicionalmente, esta erva foi usada para fazer medicina contra doenças pulmonares. A farmacologia moderna também fornece evidências da eficácia do PG para o tratamento de outras doenças. Estudos têm demonstrado que o PG tem um efeito terapêutico em uma variedade de modelos de lesão hepática induzida por drogas. A suplementação dietética de extratos de PG ou platicodina pode amenizar a obesidade induzida por dieta hiperlipídica e suas doenças metabólicas relacionadas ^3,4,5. Polissacarídeos de PG podem ser utilizados no tratamento da lesão hepática aguda causada por LPS/D-GalN em camundongos⁶. Além disso, as saponinas das raízes do PG melhoram a esteatohepatite não alcoólica induzida por dieta hiperlipética (EHNA)⁷. Além disso, a platicodina D (PD), um dos mais importantes componentes terapêuticos do PG, pode aumentar a expressão do receptor de lipoproteína de baixa densidade e a captação de lipoproteína de baixa densidade em células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2)⁸. Além disso, a DP também pode induzir apoptose e inibir a adesão, migração e invasão^{em células} HepG29,10. Assim, neste estudo, células AML-12 de hepatoma de camundongo são utilizadas para a construção de modelos in vitro e para aprofundar o estudo dos efeitos farmacológicos e mecanismos subjacentes da DP nesse modelo.

O termo doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) refere-se a um grupo de doenças hepáticas que inclui esteatose simples, EHNA, cirrose e carcinoma^{hepatocelular11}. Embora a patogênese da DHGNA seja incompletamente compreendida, desde a teoria clássica dos “dois acertos” até a atual teoria dos “múltiplos acertos”, a resistência à insulina é considerada central na patogênese da DHGNA^12,13,14. Estudos têm demonstrado que a resistência à insulina nos hepatócitos poderia levar ao aumento dos ácidos graxos livres, que formam triglicerídeos que se depositam no fígado e causam gordurinhas no fígado^15,16. O acúmulo de gordura pode levar à lipotoxicidade, disfunção mitocondrial induzida por estresse oxidativo, estresse do retículo endoplasmático e liberação de citocinas inflamatórias, resultando na patogênese e progressão da DHGNA^17,18. Além disso, a autofagia também desempenha um papel na patogênese da DHGNA, pois está envolvida na regulação da sensibilidade celular à insulina, do metabolismo lipídico celular, da lesão dos hepatócitos e da imunidade inata 19,20,21.

Uma variedade de modelos animais e modelos celulares tem sido estabelecida para fornecer uma base para explorar a patogênese e potenciais alvos terapêuticos da DHGNA^22,23. No entanto, modelos animais isolados não conseguem mimetizar completamente todos os processos patológicos da DHGNA²⁴. Diferenças individuais entre os animais levam a diferentes características patológicas. O uso de linhagens celulares hepáticas ou hepatócitos primários em estudos in vitro de DHGNA garante a máxima consistência nas condições experimentais. A desregulação do metabolismo lipídico hepático pode levar a níveis mais elevados de acúmulo de gotículas lipídicas de hepatócitos na DHGNA²⁵. Ácidos graxos livres, como ácido oleico e óleo de palma, têm sido utilizados no modelo in vitro para mimetizar a DHGNA causada por uma dieta hiperlipídica^26,27. A linhagem celular HepG2 do hepatoblastoma humano é frequentemente utilizada na construção de modelos de DHGNA in vitro, mas, como linhagem celular tumoral, o metabolismo das células HepG2 é significativamente diferente daquele das células hepáticas em condições fisiológicas^normais28. Portanto, o uso de hepatócitos primários ou hepatócitos primários de camundongos para construir o modelo de DHGNA in vitro para triagem de drogas é mais vantajoso do que o uso de linhagens de células tumorais. Comparando o exame sinérgico dos efeitos de drogas e alvos terapêuticos em modelos animais e modelos de hepatócitos in vitro, parece que o uso de hepatócitos de camundongo para construir o modelo in vitro de DHGNA tem melhor potencial de aplicação.

Os ácidos graxos livres que entram no fígado são oxidados para produzir energia ou armazenados como triglicerídeos. Significativamente, os ácidos graxos livres apresentam certa lipotoxicidade e podem induzir disfunção celular e apoptose¹². O ácido palmítico (AP) é o ácido graxo saturado mais abundante no plasma humano²⁹. Quando as células do tecido não adiposo são expostas a altas concentrações de AF por longo tempo, isso estimula a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e causa estresse oxidativo, acúmulo de lipídios e até apoptose³⁰. Portanto, muitos pesquisadores utilizam a AP como indutor para estimular as células hepáticas a produzirem ERO e, assim, construir o modelo de doença hepática gordurosa in vitro e avaliar os efeitos protetores de determinadas substâncias ativas sobre as células^31,32,33,34. Este estudo apresenta um protocolo para investigar os efeitos protetores da DP em um modelo celular de DHGNA induzida por AF.

Protocol

As células AML-12 (uma linhagem normal de hepatócitos de camundongos) são usadas para os estudos baseados em células. As células são obtidas de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). 1. Pré-tratamento das células AML-12 para modelagem da DHGNA in vitro Manter as células em meios de cultura celular normais (DMEM mais F12 de Ham’s [1:1] contendo 0,005 mg/mL de insulina, 5 ng/mL de selênio, 0,005 mg/mL de transferrina, 40 ng/…

Representative Results

ERO intracelular nas célulasCélulas AML-12 foram induzidas com 300 μM de PA por 24 h, e um modelo de célula NAFLD foi estabelecido. Posteriormente, as células foram tratadas com DP por 24 horas. As células foram marcadas com uma sonda fluorescente DCFH-DA, e a produção de ROS foi observada em microscópio de fluorescência. Os resultados da coloração DCFH-DA das ERO intracelulares nas células são mostrados na Figura 1. Os resultados mostraram que a DP pode re…

Discussion

Estudos têm destacado o fato de que a DHGNA é uma síndrome clinicopatológica, que varia de esteatose hepática a EHNA, que pode evoluir para cirrose e câncer hepático⁵¹. Uma dieta rica em gordura e um estilo de vida inativo são fatores de risco típicos para DHGNA. Tanto terapias não medicamentosas quanto terapias medicamentosas para o tratamento da DHGNA têm sido pesquisadas^51,52,53. Entretanto,…

Materials

5% BSA Blocking Buffer	Solarbio, Beijing, China	SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line	Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China	AML12
Beyo ECL Plus	Beyotime, Shanghai, China	P0018S
Bio-safety cabinet	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	AC2-5S1 A2
cellSens	Olympus, Tokyo, Japan	1.8
Culture CO2 Incubator	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	CCL-170B-8
Dexamethasone	Beyotime, Shanghai, China	ST125
Dimethyl sulfoxide	Solarbio, Beijing, China	D8371
DMEM/F12	Hyclone, Logan, UT, USA	SH30023.01
Foetal Bovine Serum	Hyclone, Tauranga, New Zealand	SH30406.05
Graphpad software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	ABclonal, Wuhan, China	AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane	Merck, Darmstadt, Germany	IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×	Beyotime, Shanghai, China	C0341
MAP LC3β Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1	Solarbio, Beijing, China	M8650
Olympus Inverted Microscope IX53	Olympus, Tokyo, Japan	IX53
Palmitic Acid	Sigma, Germany	P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	Hyclone, Logan, UT, USA	SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Beyotime, Shanghai, China	ST506
Phosphate Buffered Solution	Hyclone, Logan, UT, USA	BL302A
Platycodin D	Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China	CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x	Beyotime, Shanghai, China	P1005
Protein Marker	Solarbio, Beijing, China	PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit	Solarbio, Beijing, China	CA1410
RIPA Lysis Buffer	Beyotime, Shanghai, China	P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime, Shanghai, China	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Beyotime, Shanghai, China	P0015
Sigma Centrifuge	Sigma, Germany	3K15
SQSTM1/p62 Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO	Tecan Austria GmbH, Austria	1510002987
WB Transfer Buffer,10x	Solarbio, Beijing, China	D1060
β-Actin Mouse mAb	ABclonal, Wuhan, China	AC004