Contactmodus Atomic Force Microscopie als een snelle techniek voor morfologische observatie en bacteriële celschadeanalyse
Summary
Hier presenteren we de toepassing van atomic force microscopy (AFM) als een eenvoudige en snelle methode voor bacteriële karakterisering en analyseren we details zoals de bacteriële grootte en vorm, bacteriële cultuurbiofilms en de activiteit van nanodeeltjes als bactericiden.
Abstract
Elektronenmicroscopie is een van de hulpmiddelen die nodig zijn om cellulaire structuren te karakteriseren. De procedure is echter ingewikkeld en duur vanwege de monstervoorbereiding voor observatie. Atomic force microscopy (AFM) is een zeer nuttige karakteriseringstechniek vanwege de hoge resolutie in drie dimensies en vanwege de afwezigheid van enige vereiste voor vacuüm- en monstergeleidbaarheid. AFM kan een grote verscheidenheid aan monsters in beeld brengen met verschillende topografieën en verschillende soorten materialen.
AFM levert hoge resolutie 3D-topografie-informatie van het angstromniveau tot de micronschaal. In tegenstelling tot traditionele microscopie gebruikt AFM een sonde om een beeld te genereren van de oppervlaktetopografie van een monster. In dit protocol wordt het gebruik van dit type microscopie voorgesteld voor de morfologische en celschadekarakterisering van bacteriën die op een drager zijn gefixeerd. Er werden stammen van Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) en Pseudomonas hunanensis (geïsoleerd uit knoflookbolmonsters) gebruikt. In dit werk werden bacteriële cellen gekweekt in specifieke kweekmedia. Om celschade te observeren, werden Staphylococcus aureus en Escherichia coli geïncubeerd met verschillende concentraties nanodeeltjes (NP’s).
Een druppel bacteriële suspensie werd op een glazen drager bevestigd en er zijn op verschillende schalen beelden gemaakt met AFM. De verkregen beelden toonden de morfologische kenmerken van de bacteriën. Verder was het met behulp van de AFM mogelijk om de schade aan de cellulaire structuur te observeren die werd veroorzaakt door het effect van NP’s. Op basis van de verkregen beelden kan contact AFM worden gebruikt om de morfologie van bacteriële cellen die op een drager zijn gefixeerd te karakteriseren. De AFM is ook een geschikt instrument voor het onderzoek naar de effecten van NP’s op bacteriën. In vergelijking met elektronenmicroscopie is AFM een goedkope en gebruiksvriendelijke techniek.
Introduction
Verschillende bacteriële vormen werden voor het eerst opgemerkt door Antony van Leeuwenhoek in de 17e eeuw1. Bacteriën bestaan al sinds de oudheid in een grote diversiteit aan vormen, variërend van bollen tot vertakkende cellen2. Celvorm is een fundamentele voorwaarde voor bacteriële taxonomen om elke bacteriesoort te beschrijven en te classificeren, voornamelijk voor de morfologische scheiding van grampositieve en gramnegatieve phyla3. Van verschillende elementen is bekend dat ze bacteriële celvormen bepalen, die allemaal betrokken zijn bij de celafdekkingen en ondersteuning als componenten van de celwand en het membraan, evenals in het cytoskelet. Op deze manier zijn wetenschappers nog steeds bezig met het ophelderen van de chemische, biochemische en fysische mechanismen en processen die betrokken zijn bij het bepalen van bacteriële celvormen, die allemaal worden gedefinieerd door clusters van genen die bacteriële vormen definiëren 2,4.
Bovendien hebben wetenschappers aangetoond dat de staafvorm waarschijnlijk de voorouderlijke vorm van bacteriële cellen is, omdat deze celvorm optimaal lijkt in cel-significante parameters. Zo worden cocci, spiraal, vibrio, filamenteuze en andere vormen beschouwd als aanpassingen aan verschillende omgevingen; Inderdaad, bepaalde morfologieën zijn meerdere keren onafhankelijk geëvolueerd, wat suggereert dat de vormen van bacteriën aanpassingen kunnen zijn aan bepaalde omgevingen 3,5. Gedurende de levenscyclus van de bacteriële cel verandert de celvorm echter, en dit gebeurt ook als een genetische reactie op schadelijke omgevingsomstandigheden3. De vorm en grootte van de bacteriële cellen bepalen sterk de stijfheid, robuustheid en oppervlakte-volumeverhouding van de bacteriën, en deze eigenschap kan worden gebruikt voor biotechnologische processen6.
Elektronische microscopie wordt gebruikt om biologische monsters te bestuderen vanwege de hoge vergroting die kan worden bereikt buiten op licht gebaseerde microscopen. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en scanningelektronenmicroscopie (SEM) zijn de meest gebruikte technieken voor dit doel; monsters vereisen echter enkele behandelingen voordat ze in de kamer van de microscoop worden geplaatst om geschikte beelden te verkrijgen. Een gouden omslag op de monsters is vereist en de tijd die wordt gebruikt voor de totale beeldacquisitie mag niet te lang zijn. Atomic force microscopy (AFM) is daarentegen een techniek die veel wordt gebruikt bij de analyse van oppervlakken, maar wordt ook gebruikt bij de studie van biologische monsters.
Er zijn verschillende soorten AFM-modi die worden gebruikt bij oppervlakteanalyse, zoals contactmodus, contactloze modus of tikken, magnetische krachtmicroscopie (MFM), geleidende AFM, piëzo-elektrische krachtmicroscopie (PFM), piekkrachttap (PFT), contactresonantie en krachtvolume. Elke modus wordt gebruikt bij de analyse van materialen en biedt verschillende informatie over het oppervlak van de materialen en hun mechanische en fysieke eigenschappen. Sommige AFM-modi worden echter gebruikt voor de analyse van biologische monsters in vitro, zoals PFT, omdat PFT het mogelijk maakt om topografische en mechanische gegevens over cellen in een vloeibaar mediumte verkrijgen 7.
In dit werk gebruikten we de meest elementaire modus die in elk oud en eenvoudig AFM-model is opgenomen- de contactmodus. AFM gebruikt een scherpe sonde (ongeveer <50 nm in diameter) om gebieden kleiner dan 100 μm te scannen. De sonde wordt uitgelijnd met het monster om te interageren met de krachtvelden die aan het monster zijn gekoppeld. Het oppervlak wordt gescand met de sonde om de kracht constant te houden. Vervolgens wordt een beeld van het oppervlak gegenereerd door de beweging van de cantilever te volgen terwijl deze over het oppervlak beweegt. De verzamelde informatie biedt de nanomechanische eigenschappen van het oppervlak, zoals de hechting, elasticiteit, viscositeit en afschuiving.
In de AFM-contactmodus wordt de cantilever met een vaste doorbuiging over het monster gescand. Hierdoor kan men de hoogte van de monsters (Z) bepalen, en dit is een voordeel ten opzichte van de andere elektronische microscooptechnieken. De AFM-software maakt het mogelijk om een 3D-beeldscan te genereren door de interactie tussen de tip en het monsteroppervlak, en de tipafbuiging wordt gecorreleerd aan de hoogte van het monster door middel van een laser en een detector.
In statische modus (contactmodus) met constante kracht presenteert de uitgang twee verschillende beelden: de hoogte (z-topografie) en het afbuigings- of foutsignaal. De statische modus is een waardevolle, eenvoudige beeldvormingsmodus, vooral voor robuuste monsters in lucht die de hoge belastingen en torsiekrachten van de statische modus aankunnen. De doorbuigings- of foutmodus wordt gebruikt in de constante krachtmodus. Het topografiebeeld wordt echter verder verbeterd door het afbuigsignaal aan de oppervlaktestructuur toe te voegen. In deze modus wordt het afbuigingssignaal ook wel het foutsignaal genoemd, omdat de afbuiging de feedbackparameter is; Alle kenmerken of morfologie die in dit kanaal verschijnen, zijn te wijten aan de “fout” in de feedbacklus of, beter gezegd, aan de feedbacklus die nodig is om een constant afbuigingsinstelpunt te behouden.
Het unieke ontwerp van AFM maakt het compact – klein genoeg om op een tafelblad te passen – terwijl het ook een resolutie heeft die hoog genoeg is om atomaire stappen op te lossen. De AFM-apparatuur heeft lagere kosten dan de apparatuur voor andere elektronische microscopen en de onderhoudskosten zijn minimaal. De microscoop vereist geen laboratorium met speciale omstandigheden zoals een cleanroom of een geïsoleerde ruimte; Het heeft alleen een trillingsvrij bureau nodig. Voor AFM hoeven de monsters geen uitgebreide voorbereiding te ondergaan zoals bij andere technieken (goudbedekking, afslanken); alleen een droog monster hoeft aan de monsterhouder te worden bevestigd.
We gebruiken de AFM-contactmodus om bacteriële morfologieën en de effecten van NP’s te observeren. De populatie en cellulaire morfologie van bacteriën die op een drager zijn gefixeerd, kunnen worden waargenomen, evenals de cellulaire schade die door nanodeeltjes op de bacteriesoort wordt geproduceerd. De beelden verkregen door de AFM-contactmodus bevestigen dat het een krachtig hulpmiddel is en niet wordt beperkt door reagentia en gecompliceerde procedures, waardoor het een eenvoudige, snelle en economische methode is voor bacteriële karakterisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microscopie is een techniek die vaak wordt gebruikt in biologische laboratoria en die het mogelijk maakt om de structuur, grootte, morfologie en cellulaire rangschikking van biologische monsters te onderzoeken. Om deze techniek te verbeteren, kunnen verschillende soorten microscopen worden gebruikt die van elkaar verschillen in termen van hun optische of elektronische kenmerken, die het resolutievermogen van het instrument bepalen.
In wetenschappelijk onderzoek is het gebruik van microscopie v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ramiro Muniz-Diaz bedankt CONACyT voor de beurs.
Materials
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
Riferimenti
- Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
- Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367 (2015).
- Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology. Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).
- Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. Bacterial cell shape. Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).
- Smith, W. P., et al. Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).
- Volke, D. C., Nikel, P. I. Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories. Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).
- Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology. Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).
- Hoffman, C. S., Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).
- Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
- Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).
- Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure. Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stackebrandt, E., Ebers, J. Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards. Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).
- Muñiz Diaz, R., et al. Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria. Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).
- Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).
- Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods. 42 (4), 321-324 (2007).
- Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).
- Yamada, S., et al. autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).
- Zuttion, F., et al. The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy. Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).
- Kahli, H., et al. Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).
- Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations. World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).
- Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents. Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).
- Lee, H. -. E., et al. NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains. Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).
- Song, L. Y., et al. Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food. Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).
- Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock. Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).
- Shar, S. S., et al. Biomineralization of platinum by Escherichia coli. Metals. 9 (4), 407 (2019).
- Baidamshina, D., et al. Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease. Scientific Reports. 7, 46068 (2017).
- Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).
