Kontaktmodus Rasterkraftmikroskopie als schnelle Technik zur morphologischen Beobachtung und bakteriellen Zellschadensanalyse

Summary

Hier stellen wir die Anwendung der Rasterkraftmikroskopie (AFM) als einfache und schnelle Methode zur bakteriellen Charakterisierung vor und analysieren Details wie die Bakteriengröße und -form, Bakterienkulturbiofilme und die Aktivität von Nanopartikeln als Bakterizide.

Abstract

Die Elektronenmikroskopie ist eines der Werkzeuge, die zur Charakterisierung zellulärer Strukturen erforderlich sind. Das Verfahren ist jedoch aufgrund der Probenvorbereitung für die Beobachtung kompliziert und teuer. Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist eine sehr nützliche Charakterisierungstechnik, da sie eine hohe Auflösung in drei Dimensionen aufweist und keine Vakuum- und Probenleitfähigkeit erforderlich ist. Das AFM kann eine Vielzahl von Proben mit unterschiedlichen Topografien und unterschiedlichen Materialtypen abbilden.

AFM liefert hochauflösende 3D-Topographieinformationen vom Ångström-Niveau bis zum Mikrometer-Maßstab. Im Gegensatz zur herkömmlichen Mikroskopie wird beim AFM eine Sonde verwendet, um ein Bild der Oberflächentopographie einer Probe zu erzeugen. In diesem Protokoll wird die Verwendung dieser Art der Mikroskopie für die morphologische und zellschädigende Charakterisierung von Bakterien vorgeschlagen, die auf einem Träger fixiert sind. Es wurden Stämme von Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) und Pseudomonas hunanensis (isoliert aus Knoblauchknollenproben) verwendet. In dieser Arbeit wurden Bakterienzellen in spezifischen Nährmedien gezüchtet. Zur Beobachtung der Zellschädigung wurden Staphylococcus aureus und Escherichia coli mit unterschiedlichen Konzentrationen von Nanopartikeln (NPs) inkubiert.

Ein Tropfen Bakteriensuspension wurde auf einem Glasträger fixiert, und Bilder wurden mit AFM in verschiedenen Maßstäben aufgenommen. Die gewonnenen Bilder zeigten die morphologischen Eigenschaften der Bakterien. Darüber hinaus konnte mit Hilfe von AFM die Schädigung der Zellstruktur durch die Wirkung von NPs beobachtet werden. Basierend auf den erhaltenen Bildern kann das Kontakt-AFM verwendet werden, um die Morphologie von Bakterienzellen zu charakterisieren, die auf einem Träger fixiert sind. Das AFM ist auch ein geeignetes Werkzeug, um die Auswirkungen von NPs auf Bakterien zu untersuchen. Im Vergleich zur Elektronenmikroskopie ist das AFM eine kostengünstige und einfach anzuwendende Technik.

Introduction

Verschiedene Bakterienformen wurden erstmals von Antony van Leeuwenhoek im 17. Jahrhundert festgestellt¹. Bakterien gibt es seit der Antike in einer Vielzahl von Formen, die von Kugeln bis hin zu verzweigten Zellen^{reichen 2}. Die Zellform ist eine grundlegende Voraussetzung für bakterielle Taxonomen, um jede Bakterienart zu beschreiben und zu klassifizieren, hauptsächlich für die morphologische Trennung von grampositiven und gramnegativen Stämmen³. Zur Bestimmung bakterieller Zellformen sind mehrere Elemente bekannt, die alle an der Zellhülle und -stütze als Bestandteile der Zellwand und -membran sowie im Zytoskelett beteiligt sind. Auf diese Weise sind die Wissenschaftler immer noch dabei, die chemischen, biochemischen und physikalischen Mechanismen und Prozesse aufzuklären, die an der Bestimmung bakterieller Zellformen beteiligt sind, die alle durch Gencluster definiert sind, die bakterielle Formen definieren ^2,4.

Darüber hinaus haben Wissenschaftler gezeigt, dass die Stäbchenform wahrscheinlich die Urform von Bakterienzellen ist, da diese Zellform in zellsignifikanten Parametern optimal erscheint. So werden Kokken, Spiralen, Vibrionen, Faden und andere Formen als Anpassungen an verschiedene Umgebungen betrachtet; In der Tat haben sich bestimmte Morphologien mehrfach unabhängig voneinander entwickelt, was darauf hindeutet, dass die Formen von Bakterien Anpassungen an bestimmte Umgebungen sein könnten ^3,5. Während des gesamten Lebenszyklus der bakteriellen Zellen ändert sich jedoch die Zellform, und dies geschieht auch als genetische Reaktion auf schädliche Umweltbedingungen³. Die Form und Größe der Bakterienzellen bestimmen stark die Steifigkeit, Robustheit und das Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis der Bakterien, und diese Eigenschaft kann für biotechnologische Prozesse genutzt werden⁶.

Die elektronische Mikroskopie wird aufgrund der hohen Vergrößerung, die über lichtbasierte Mikroskope hinaus erreicht werden kann, zur Untersuchung biologischer Proben eingesetzt. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Rasterelektronenmikroskopie (REM) sind die am häufigsten verwendeten Techniken für diesen Zweck; Die Proben benötigen jedoch einige Behandlungen, bevor sie in die Kammer des Mikroskops gelegt werden, um geeignete Bilder zu erhalten. Eine goldene Abdeckung der Proben ist erforderlich, und die Zeit, die für die gesamte Bildaufnahme benötigt wird, sollte nicht zu lang sein. Im Gegensatz dazu ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM) eine Technik, die bei der Analyse von Oberflächen weit verbreitet ist, aber auch bei der Untersuchung biologischer Proben eingesetzt wird.

Es gibt verschiedene Arten von AFM-Modi, die in der Oberflächenanalyse verwendet werden, z. B. Kontaktmodus, berührungsloser Modus oder Gewindebohren, Magnetkraftmikroskopie (MFM), konduktives AFM, piezoelektrische Kraftmikroskopie (PFM), Spitzenkraftabgriff (PFT), Kontaktresonanz und Kraftvolumen. Jeder Modus wird bei der Analyse von Materialien verwendet und liefert unterschiedliche Informationen über die Oberfläche der Materialien und ihre mechanischen und physikalischen Eigenschaften. Einige AFM-Modi werden jedoch für die In-vitro-Analyse biologischer Proben verwendet, wie z. B. PFT, da PFT die Gewinnung topographischer und mechanischer Daten über Zellen in einem flüssigen Medium ermöglicht⁷.

In dieser Arbeit haben wir den grundlegendsten Modus verwendet, der in jedem alten und einfachen AFM-Modell enthalten ist – den Kontaktmodus. Das AFM verwendet eine scharfe Sonde (ca. <50 nm Durchmesser), um Bereiche mit einer Größe von weniger als 100 μm zu scannen. Die Sonde wird auf die Probe ausgerichtet, um mit den mit der Probe verbundenen Kraftfeldern zu interagieren. Die Oberfläche wird mit der Sonde abgetastet, um die Kraft konstant zu halten. Anschließend wird ein Bild der Oberfläche erzeugt, indem die Bewegung des Auslegers überwacht wird, während er sich über die Oberfläche bewegt. Die gesammelten Informationen liefern die nanomechanischen Eigenschaften der Oberfläche, wie Haftung, Elastizität, Viskosität und Scherung.

Im AFM-Kontaktmodus wird der Cantilever mit einer festen Auslenkung über die Probe abgetastet. Dadurch kann die Höhe der Proben (Z) bestimmt werden, was einen Vorteil gegenüber den anderen elektronischen Mikroskoptechniken darstellt. Die AFM-Software ermöglicht die Erzeugung eines 3D-Bildscans durch die Wechselwirkung zwischen der Spitze und der Probenoberfläche, und die Spitzenauslenkung wird durch einen Laser und einen Detektor mit der Höhe der Probe korreliert.

Im statischen Modus (Kontaktmodus) mit konstanter Kraft stellt der Ausgang zwei verschiedene Bilder dar: die Höhe (z-Topographie) und das Auslenkungs- oder Fehlersignal. Der statische Modus ist ein wertvoller, einfacher Bildgebungsmodus, insbesondere für robuste Proben in Luft, die den hohen Belastungen und Torsionskräften des statischen Modus standhalten können. Der Auslenkungs- oder Fehlermodus wird im Konstantkraftmodus betrieben. Das Topographiebild wird jedoch durch Hinzufügen des Ablenksignals zur Oberflächenstruktur weiter verbessert. In diesem Modus wird das Ablenksignal auch als Fehlersignal bezeichnet, da die Auslenkung der Rückkopplungsparameter ist. Alle Merkmale oder Morphologien, die in diesem Kanal auftreten, sind auf den “Fehler” in der Rückkopplungsschleife oder vielmehr auf die Rückkopplungsschleife zurückzuführen, die erforderlich ist, um einen konstanten Auslenkungssollwert aufrechtzuerhalten.

Das einzigartige Design von AFM macht es kompakt – klein genug, um auf eine Tischplatte zu passen – und hat gleichzeitig eine hohe Auflösung, um atomare Schritte aufzulösen. Die AFM-Geräte sind kostengünstiger als die Geräte für andere elektronische Mikroskope, und die Wartungskosten sind minimal. Das Mikroskop benötigt kein Labor mit besonderen Bedingungen wie einem Reinraum oder einem isolierten Raum. Es braucht nur einen vibrationsfreien Schreibtisch. Für das AFM müssen die Proben nicht wie bei anderen Techniken (Goldabdeckung, Schlankheitsmessung) aufwendig aufbereitet werden. Lediglich eine trockene Probe muss am Probenhalter befestigt werden.

Wir verwenden den AFM-Kontaktmodus, um bakterielle Morphologien und die Auswirkungen von NPs zu beobachten. Die Population und Zellmorphologie von Bakterien, die auf einem Träger fixiert sind, können ebenso beobachtet werden wie die zellulären Schäden, die durch Nanopartikel an den Bakterienarten verursacht werden. Die Bilder, die mit dem AFM-Kontaktmodus erhalten wurden, bestätigen, dass es sich um ein leistungsstarkes Werkzeug handelt, das nicht durch Reagenzien und komplizierte Verfahren eingeschränkt ist, was es zu einer einfachen, schnellen und wirtschaftlichen Methode zur Charakterisierung von Bakterien macht.

Protocol

1. Bakterielle Isolierung und Identifizierung Isolierung eines endophytischen Stammes aus Knoblauchknollenmeristemen:Legen Sie 2 mm Meristemfragmente von zuvor geschälten, desinfizierten und geschnittenen Knoblauchknollen auf Trypticase-Soja-Agar (TSA) als reichhaltiges Wachstumsmedium und inkubieren Sie 1 Tag lang bei 25 °C. Basierend auf den morphologischen Unterschieden der Bakterienkolonien – Form, Größe, Farbe, Rand, Durchlicht, reflektiertes Licht, Textur, Konsisten…

Representative Results

Bilder der Morphologie und Größe der Stämme von S. aureus und P. hunanensis sowie der Populationsorganisation beider Stämme wurden mittels Rasterkraftmikroskopie im Kontaktmodus aufgenommen. Die Bilder von S. aureus zeigten, dass die Population nach Zonen mit Kokkenaggregaten verteilt war (Abbildung 1A). Mit zunehmender Größe wurden die Populationsverteilung und die Morphologie der Kokken besser bewertet (Abbildung 1B). Die Mikr…

Discussion

Die Mikroskopie ist eine Technik, die häufig in biologischen Laboratorien verwendet wird und die Untersuchung der Struktur, Größe, Morphologie und zellulären Anordnung biologischer Proben ermöglicht. Um diese Technik zu verbessern, können verschiedene Arten von Mikroskopen verwendet werden, die sich in ihren optischen oder elektronischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, die das Auflösungsvermögen des Instruments bestimmen.

In der wissenschaftlichen Forschung ist der Einsatz der…

Materials

AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions