מצב מגע מיקרוסקופ כוח אטומי כטכניקה מהירה לתצפית מורפולוגית וניתוח נזק לתאי חיידקים

Summary

כאן אנו מציגים את היישום של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) כשיטה פשוטה ומהירה לאפיון חיידקים ומנתחים פרטים כגון גודל וצורת החיידקים, ביופילמים של תרבית חיידקים ופעילות ננו-חלקיקים כקוטלי חיידקים.

Abstract

מיקרוסקופ אלקטרונים הוא אחד הכלים הדרושים לאפיון מבנים תאיים. עם זאת, ההליך מסובך ויקר בשל הכנת הדגימה לתצפית. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) היא טכניקת אפיון שימושית מאוד בשל הרזולוציה הגבוהה שלה בתלת מימד ובשל היעדר כל דרישה למוליכות ואקום ודגימה. AFM יכול לצלם מגוון רחב של דגימות עם טופוגרפיות שונות וסוגים שונים של חומרים.

AFM מספק מידע טופוגרפי תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה מרמת האנגסטרום ועד לסולם המיקרון. שלא כמו מיקרוסקופיה מסורתית, AFM משתמש בגשושית כדי ליצור תמונה של טופוגרפיית פני השטח של דגימה. בפרוטוקול זה, השימוש במיקרוסקופ מסוג זה מוצע לאפיון מורפולוגי ונזק תאי של חיידקים המקובעים על תמיכה. נעשה שימוש בזנים של Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) ו-Pseudomonas hunanensis (שבודדו מדגימות פקעת שום). בעבודה זו גודלו תאי חיידק בתרבית ספציפית. כדי לצפות בנזק לתאים, Staphylococcus aureus ו- Escherichia coli הודגרו עם ריכוזים שונים של ננו-חלקיקים (NPs).

טיפה של מתלה חיידקי נקבעה על תומך זכוכית, ותמונות צולמו עם AFM בקני מידה שונים. התמונות שהתקבלו הראו את המאפיינים המורפולוגיים של החיידקים. יתר על כן, באמצעות AFM, ניתן היה לצפות בנזק למבנה התא שנגרם על ידי ההשפעה של NPs. בהתבסס על התמונות שהתקבלו, AFM מגע יכול לשמש כדי לאפיין את המורפולוגיה של תאי חיידקים קבועים על תמיכה. AFM הוא גם כלי מתאים לחקר ההשפעות של NPs על חיידקים. בהשוואה למיקרוסקופ אלקטרונים, AFM היא טכניקה זולה וקלה לשימוש.

Introduction

צורות חיידקים שונות זוהו לראשונה על ידי אנטוני ואן לוונהוק במאה ה-17¹. חיידקים קיימים במגוון גדול של צורות מאז ימי קדם, החל מכדוריות ועד תאים מסתעפים². צורת התא היא תנאי בסיסי עבור טקסונומים חיידקיים לתאר ולסווג כל מין חיידקי, בעיקר עבור ההפרדה המורפולוגית של פילה גראם-חיובי וגרם שלילי^{פילה 3}. מספר אלמנטים ידועים כקובעים את צורות התא החיידקי, כולם מעורבים בכיסויי התא ותומכים בהם כמרכיבים של דופן התא וקרום התא, כמו גם בשלד התא. בדרך זו, מדענים עדיין מבהירים את המנגנונים והתהליכים הכימיים, הביוכימיים והפיזיקליים המעורבים בקביעת צורות תאי חיידקים, שכולם מוגדרים על-ידי צבירי גנים המגדירים צורות חיידקים ^2,4.

בנוסף, מדענים הראו כי צורת המוט היא ככל הנראה הצורה הקדומה של תאי חיידקים, שכן צורת תא זו נראית אופטימלית בפרמטרים משמעותיים לתא. לפיכך, צורות קוקוס, ספירלה, ויבריו, נימה וצורות אחרות נחשבות כהתאמות לסביבות שונות; ואכן, מורפולוגיות מסוימות התפתחו באופן עצמאי מספר פעמים, מה שמרמז על כך שצורות של חיידקים יכולות להיות התאמות לסביבות מסוימות ^3,5. עם זאת, לאורך מחזור החיים של תא החיידק, צורת התא משתנה, וזה קורה גם כתגובה גנטית לתנאי סביבה מזיקים³. צורת תא החיידק וגודלו, קובעים במידה רבה את הנוקשות, החוסן והיחס בין פני השטח לנפח של החיידקים, וניתן לנצל תכונה זו לתהליכים ביוטכנולוגיים⁶.

מיקרוסקופיה אלקטרונית משמשת לחקר דגימות ביולוגיות בשל ההגדלה הגבוהה שניתן להגיע אליה מעבר למיקרוסקופים מבוססי אור. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הן הטכניקות הנפוצות ביותר למטרה זו; עם זאת, דגימות דורשות כמה טיפולים לפני שהם ממוקמים לתוך החדר של המיקרוסקופ על מנת לקבל תמונות מתאימות. כיסוי זהב על הדגימות נדרש, ואת הזמן המשמש לרכישת התמונה הכוללת לא צריך להיות ארוך מדי. לעומת זאת, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) היא טכניקה בשימוש נרחב בניתוח משטחים, אך משמשת גם בחקר דגימות ביולוגיות.

ישנם מספר סוגים של מצבי AFM המשמשים בניתוח פני שטח, כגון מצב מגע, מצב ללא מגע או הקשה, מיקרוסקופ כוח מגנטי (MFM), AFM מוליך, מיקרוסקופ כוח פיאזואלקטרי (PFM), הקשה על כוח שיא (PFT), תהודה במגע ועוצמת כוח. כל מצב משמש בניתוח חומרים ומספק מידע שונה על פני השטח של החומרים ותכונותיהם המכניות והפיזיקליות. עם זאת, מצבי AFM מסוימים משמשים לניתוח דגימות ביולוגיות במבחנה, כגון PFT, מכיוון ש- PFT מאפשר קבלת נתונים טופוגרפיים ומכניים על תאים בתווך נוזלי⁷.

בעבודה זו השתמשנו במצב הבסיסי ביותר הכלול בכל דגם AFM ישן ופשוט – מצב המגע. AFM משתמש בגשושית חדה (בקוטר של כ-<50 ננומטר) כדי לסרוק אזורים שגודלם פחות מ-100 מיקרומטר. הגשושית מיושרת למדגם על מנת לקיים אינטראקציה עם שדות הכוח המשויכים לדגימה. פני השטח נסרקים עם הגשושית כדי לשמור על כוח קבוע. לאחר מכן, תמונה של פני השטח נוצרת על ידי ניטור התנועה של המגן כפי שהוא נע על פני המשטח. המידע שנאסף מספק את התכונות הננו-מכניות של פני השטח, כגון היצמדות, גמישות, צמיגות וגזירה.

במצב מגע AFM, הקנטייבר נסרק על פני הדגימה בסטייה קבועה. זה מאפשר לקבוע את גובה הדגימות (Z), וזה מייצג יתרון על פני טכניקות מיקרוסקופ אלקטרוני אחרות. תוכנת AFM מאפשרת יצירת סריקת תמונה תלת-ממדית על ידי אינטראקציה בין קצה הדגימה למשטח הדגימה, והסטייה של החוד מתואמת לגובה הדגימה באמצעות לייזר וגלאי.

במצב סטטי (מצב מגע) עם כוח קבוע, הפלט מציג שתי תמונות שונות: הגובה (טופוגרפיית z) והסטייה או אות השגיאה. מצב סטטי הוא מצב הדמיה פשוט ובעל ערך, במיוחד עבור דגימות חזקות באוויר שיכולות להתמודד עם העומסים הגבוהים וכוחות הפיתול המופעלים על ידי מצב סטטי. מצב הסטייה או השגיאה מופעל במצב כוח קבוע. עם זאת, תמונת הטופוגרפיה משופרת עוד יותר על ידי הוספת אות ההסטה למבנה פני השטח. במצב זה, אות הסטייה מכונה גם אות השגיאה מכיוון שהסטייה היא פרמטר המשוב; כל התכונות או המורפולוגיה המופיעות בערוץ זה נובעות מה”שגיאה” בלולאת המשוב או, ליתר דיוק, בשל לולאת המשוב הנדרשת כדי לשמור על נקודת סטייה קבועה.

העיצוב הייחודי של AFM הופך אותו לקומפקטי – קטן מספיק כדי להתאים לשולחן – ובו בזמן ברזולוציה גבוהה מספיק כדי לפתור צעדים אטומיים. לציוד AFM יש עלות נמוכה יותר מאשר לציוד למיקרוסקופים אלקטרוניים אחרים, ועלויות התחזוקה מינימליות. המיקרוסקופ אינו דורש מעבדה עם תנאים מיוחדים כמו חדר נקי או חלל מבודד; הוא זקוק רק לשולחן עבודה נטול רטט. עבור AFM, הדגימות אינן צריכות לעבור הכנה משוכללת כמו בטכניקות אחרות (כיסוי זהב, הרזיה); יש לצרף רק דגימה יבשה למחזיק הדגימה.

אנו משתמשים במצב מגע AFM כדי לצפות במורפולוגיות חיידקיות ובהשפעות של NPs. ניתן לצפות באוכלוסייה ובמורפולוגיה התאית של חיידקים המקובעים על תמיכה, כמו גם בנזק התאי המיוצר על ידי ננו-חלקיקים על מיני החיידקים. התמונות המתקבלות על ידי מצב מגע AFM מאשרות כי זהו כלי רב עוצמה ואינו מוגבל על ידי ריאגנטים ופרוצדורות מסובכות, מה שהופך אותו לשיטה פשוטה, מהירה וחסכונית לאפיון חיידקים.

Protocol

1. בידוד וזיהוי חיידקים בידוד זן אנדופיטי מריסטמים של פקעת שום:הניחו 2 מ”מ של שברי מריסטמים מפקעות שום קלופות, מחוטאות וחתוכות בעבר על אגר סויה טריפטיקייס (TSA) כמצע צמיחה עשיר, ודגרו בטמפרטורה של 25°C למשך יום אחד. בהתבסס על ההבדלים המורפולוגיים של מושבות החיידקים – צור…

Representative Results

תמונות של המורפולוגיה והגודל של הזנים S. aureus ו- P. hunanensis , כמו גם ארגון האוכלוסייה של שני הזנים, צולמו במיקרוסקופ כוח אטומי במצב מגע. התמונות של S. aureus הראו שהאוכלוסייה שלו התפזרה לפי אזורים עם אגרגטים של קוקוס (איור 1A). עם הגידול בקנה המידה, הייתה הערכה גדולה יותר…

Discussion

מיקרוסקופיה היא טכניקה נפוצה במעבדות ביולוגיות המאפשרת לחקור את המבנה, הגודל, המורפולוגיה והסידור התאי של דגימות ביולוגיות. כדי לשפר טכניקה זו, ניתן להשתמש במספר סוגים של מיקרוסקופים השונים זה מזה מבחינת המאפיינים האופטיים או האלקטרוניים שלהם, הקובעים את כוח הרזולוציה של המכשיר.

<p class="…

Materials

AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions