접촉 모드 형태학적 관찰 및 박테리아 세포 손상 분석을 위한 신속한 기술로서의 원자력 현미경
Summary
여기에서는 박테리아 특성 분석을 위한 간단하고 빠른 방법으로 원자력 현미경(AFM)의 적용을 제시하고 박테리아 크기 및 모양, 박테리아 배양 생물막, 살균제로서의 나노 입자의 활성과 같은 세부 사항을 분석합니다.
Abstract
전자 현미경은 세포 구조를 특성화하는 데 필요한 도구 중 하나입니다. 그러나 관찰을 위한 샘플 준비로 인해 절차가 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 원자력 현미경(AFM)은 3차원의 고분해능과 진공 및 시료 전도도에 대한 요구 사항이 없기 때문에 매우 유용한 특성화 기술입니다. AFM은 다양한 지형과 다양한 유형의 재료를 가진 다양한 샘플을 이미지화할 수 있습니다.
AFM은 옹스트롬 수준에서 미크론 수준까지 고해상도 3D 지형 정보를 제공합니다. 기존의 현미경과 달리 AFM은 프로브를 사용하여 샘플의 표면 지형 이미지를 생성합니다. 이 프로토콜에서는 지지체에 고정된 박테리아의 형태학적 및 세포 손상 특성 분석을 위해 이러한 유형의 현미경 사용을 제안합니다. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus , ATCC 25923), 대장균( Escherichia coli , ATCC 25922) 및 슈도모나스 후나넨시스(Pseudomonas hunanensis )(마늘 구근 샘플에서 분리)의 균주를 사용하였다. 이 연구에서 박테리아 세포는 특정 배양 배지에서 성장했습니다. 세포 손상을 관찰하기 위해 황색포도상구 균과 대장균 을 서로 다른 농도의 나노입자(NP)와 함께 배양했습니다.
박테리아 현탁액 한 방울을 유리 지지대에 고정하고 AFM으로 이미지를 다른 스케일로 촬영했습니다. 얻어진 이미지는 박테리아의 형태 학적 특성을 보여 주었다. 또한, AFM을 채용하여, NPs의 효과에 의해 야기된 세포 구조의 손상을 관찰할 수 있었다. 얻어진 이미지를 기초로, 접촉 AFM은 지지체에 고정된 박테리아 세포의 형태를 특성화하는 데 사용될 수 있다. AFM은 또한 NP가 박테리아에 미치는 영향을 조사하는 데 적합한 도구입니다. 전자 현미경에 비해 AFM은 저렴하고 사용하기 쉬운 기술입니다.
Introduction
다른 박테리아 모양은 17 세기 Antony van Leeuwenhoek에 의해 처음 발견되었습니다1. 박테리아는 고대부터 구체에서 분지 세포에 이르기까지 매우 다양한 형태로 존재해 왔다2. 세포 모양은 박테리아 분류학자들이 각 박테리아 종을 기술하고 분류하기 위한 기본 조건으로, 주로 그람 양성 문과 그람 음성 문3의 형태학적 분리를 위한 것입니다. 박테리아 세포 형태를 결정하는 몇 가지 요소가 알려져 있으며, 이들 모두는 세포 골격뿐만 아니라 세포벽과 막의 구성 요소로서 세포 덮개 및 지지체에 관여합니다. 이런 식으로 과학자들은 박테리아 세포 형태를 결정하는 데 관련된 화학적, 생화학적, 물리적 메커니즘과 과정을 여전히 해명하고 있으며, 이 모든 것은 박테리아 모양을 정의하는 유전자 클러스터에 의해 정의됩니다 2,4.
또한 과학자들은 막대 모양이 박테리아 세포의 조상 형태일 가능성이 있음을 보여주었는데, 이는 이 세포 모양이 세포에 중요한 매개변수에서 최적으로 나타나기 때문입니다. 따라서 cocci, 나선형, vibrio, 필라멘트 및 기타 형태는 다양한 환경에 대한 적응으로 간주됩니다. 실제로, 특정 형태학은 여러 번 독립적으로 진화했으며, 이는 박테리아의 모양이 특정 환경에 적응할 수 있음을 시사합니다 3,5. 그러나 박테리아 세포 수명 주기 동안 세포 모양이 변하며, 이는 또한 유해한 환경 조건에 대한 유전적 반응으로 발생합니다3. 박테리아 세포의 모양과 크기는 박테리아의 강성, 견고성 및 표면 대 부피 비율을 강력하게 결정하며, 이러한 특성은 생명공학 공정에 이용될 수 있다6.
전자 현미경은 광학 기반 현미경을 넘어 도달할 수 있는 고배율로 인해 생물학적 샘플을 연구하는 데 사용됩니다. 투과 전자 현미경 (TEM)과 주사 전자 현미경 (SEM)은 이러한 목적으로 가장 일반적으로 사용되는 기술입니다. 그러나 샘플은 적절한 이미지를 얻기 위해 현미경 챔버에 넣기 전에 몇 가지 처리가 필요합니다. 샘플에 금색 덮개가 필요하며 전체 이미지 획득에 사용되는 시간이 너무 길어서는 안 됩니다. 대조적으로, 원자력 현미경 (AFM)은 표면 분석에 널리 사용되는 기술이지만 생물학적 샘플 연구에도 사용됩니다.
표면 분석에 사용되는 AFM 모드에는 접촉 모드, 비접촉 모드 또는 태핑, 자력 현미경(MFM), 전도성 AFM, 압전 현미경(PFM), 피크 힘 태핑(PFT), 접촉 공진 및 힘 볼륨과 같은 여러 유형이 있습니다. 각 모드는 재료 분석에 사용되며 재료 표면과 기계적 및 물리적 특성에 대한 다양한 정보를 제공합니다. 그러나, 일부 AFM 모드는 PFT와 같은 시험관내 생물학적 샘플의 분석에 사용되는데, 이는 PFT가 액체 배지(7)에서 세포에 대한 지형 및 기계적 데이터를 얻을 수 있게 해주기 때문이다.
이 작업에서는 모든 오래되고 단순한 AFM 모델에 포함된 가장 기본적인 모드인 접촉 모드를 사용했습니다. AFM은 날카로운 프로브(직경 약 <50nm)를 사용하여 100μm 미만의 영역을 스캔합니다. 프로브는 샘플과 관련된 힘장과 상호 작용하기 위해 샘플에 정렬됩니다. 표면을 프로브로 스캔하여 힘을 일정하게 유지합니다. 그런 다음 캔틸레버가 표면을 가로질러 이동할 때 캔틸레버의 움직임을 모니터링하여 표면 이미지가 생성됩니다. 수집된 정보는 접착력, 탄성, 점도 및 전단과 같은 표면의 나노 기계적 특성을 제공합니다.
AFM 접촉 모드에서는 캔틸레버가 고정된 편향으로 샘플 전체에서 스캔됩니다. 이를 통해 샘플(Z)의 높이를 결정할 수 있으며 이는 다른 전자 현미경 기술에 비해 이점을 나타냅니다. AFM 소프트웨어를 사용하면 팁과 샘플 표면 간의 상호 작용을 통해 3D 이미지 스캔을 생성할 수 있으며, 팁 편향은 레이저와 검출기를 통해 샘플 높이와 상관관계가 있습니다.
일정한 힘을 가진 정적 모드(접촉 모드)에서 출력은 높이(z 지형)와 편향 또는 오류 신호라는 두 가지 다른 이미지를 제공합니다. 정적 모드는 특히 정적 모드에서 가해지는 높은 하중과 비틀림을 처리할 수 있는 공기 중의 견고한 샘플에 유용하고 간단한 이미징 모드입니다. 처짐 또는 오류 모드는 일정한 힘 모드에서 작동됩니다. 그러나 지형 이미지는 표면 구조에 편향 신호를 추가하여 더욱 향상됩니다. 이 모드에서 편향 신호는 편향이 피드백 매개변수이기 때문에 오류 신호라고도 합니다. 이 채널에 나타나는 모든 기능 또는 형태는 피드백 루프의 “오류” 때문이거나 일정한 편향 설정값을 유지하는 데 필요한 피드백 루프 때문입니다.
AFM의 독특한 디자인은 탁상에 들어갈 만큼 충분히 작으면서도 원자 단계를 해결할 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도를 제공합니다. AFM 장비는 다른 전자 현미경 장비보다 비용이 저렴하고 유지 보수 비용이 최소화됩니다. 현미경은 클린룸이나 격리된 공간과 같은 특별한 조건의 실험실이 필요하지 않습니다. 진동이 없는 책상만 있으면 됩니다. AFM의 경우 샘플은 다른 기술(골드 커버, 슬리밍)과 같이 정교한 준비를 거칠 필요가 없습니다. 건조한 샘플만 샘플 홀더에 부착해야 합니다.
우리는 AFM 접촉 모드를 사용하여 박테리아 형태와 NP의 효과를 관찰합니다. 지지체에 고정된 박테리아의 개체군과 세포 형태뿐만 아니라 박테리아 종에 대한 나노입자에 의해 생성된 세포 손상을 관찰할 수 있습니다. AFM 접촉 모드로 얻은 이미지는 강력한 도구이며 시약 및 복잡한 절차에 의해 제한되지 않아 박테리아 특성 분석을 위한 간단하고 빠르며 경제적인 방법임을 확인합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현미경은 생물학적 샘플의 구조, 크기, 형태 및 세포 배열을 조사할 수 있는 생물학적 실험실에서 일반적으로 사용되는 기술입니다. 이 기술을 개선하기 위해 기기의 해상도를 결정하는 광학 또는 전자적 특성 측면에서 서로 다른 여러 유형의 현미경을 사용할 수 있습니다.
과학 연구에서 박테리아 세포의 특성화를 위해서는 현미경 사용이 필요합니다. 예를 들어, 현미경 검?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ramiro Muniz-Diaz는 장학금에 대해 CONACyT에 감사드립니다.
Materials
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
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