Kontaktmodus Atomkraftmikroskopi som en rask teknikk for morfologisk observasjon og bakteriell celleskadeanalyse

Summary

Her presenterer vi anvendelsen av atomkraftmikroskopi (AFM) som en enkel og rask metode for bakteriell karakterisering og analyserer detaljer som bakteriestørrelse og form, bakteriekulturbiofilm og aktiviteten til nanopartikler som bakteriedrepende midler.

Abstract

Elektronmikroskopi er et av verktøyene som kreves for å karakterisere cellulære strukturer. Prosedyren er imidlertid komplisert og kostbar på grunn av prøveforberedelsen for observasjon. Atomkraftmikroskopi (AFM) er en svært nyttig karakteriseringsteknikk på grunn av sin høye oppløsning i tre dimensjoner og på grunn av fraværet av krav til vakuum og prøveledningsevne. AFM kan avbilde et bredt utvalg av prøver med forskjellige topografier og forskjellige typer materialer.

AFM gir høyoppløselig 3D-topografiinformasjon fra angstromnivå til mikronskala. I motsetning til tradisjonell mikroskopi bruker AFM en sonde for å generere et bilde av overflatetopografien til en prøve. I denne protokollen foreslås bruk av denne typen mikroskopi for morfologisk og celleskadekarakterisering av bakterier festet på en støtte. Stammer av Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) og Pseudomonas hunanensis (isolert fra hvitløkspæreprøver) ble brukt. I dette arbeidet ble bakterieceller dyrket i bestemte kulturmedier. For å observere celleskader ble Staphylococcus aureus og Escherichia coli inkubert med forskjellige konsentrasjoner av nanopartikler (NP).

En dråpe bakteriell suspensjon ble festet på en glassstøtte, og bilder ble tatt med AFM i forskjellige skalaer. De oppnådde bildene viste bakteriens morfologiske egenskaper. Videre, ved bruk av AFM, var det mulig å observere skaden på den cellulære strukturen forårsaket av effekten av NP. Basert på bildene som er oppnådd, kan kontakt AFM brukes til å karakterisere morfologien til bakterielle celler festet på en støtte. AFM er også et egnet verktøy for undersøkelse av effekten av NP på bakterier. Sammenlignet med elektronmikroskopi er AFM en billig og brukervennlig teknikk.

Introduction

Ulike bakterieformer ble først notert av Antony van Leeuwenhoek i det 17. århundre¹. Bakterier har eksistert i et stort mangfold av former siden antikken, alt fra kuler til forgreningsceller². Celleform er en grunnleggende betingelse for bakterielle taksonomer for å beskrive og klassifisere hver bakterieart, hovedsakelig for morfologisk separasjon av gram-positiv og gram-negativ phyla³. Flere elementer er kjent for å bestemme bakterielle celleformer, som alle er involvert i celledekslene og støtten som komponenter i celleveggen og membranen, så vel som i cytoskelettet. På denne måten belyser forskere fortsatt de kjemiske, biokjemiske og fysiske mekanismene og prosessene som er involvert i å bestemme bakterielle celleformer, som alle er definert av klynger av gener som definerer bakterieformer ^2,4.

I tillegg har forskere vist at stavformen sannsynligvis er den forfedre formen av bakterieceller, siden denne celleformen ser ut til å være optimal i cellesignifikante parametere. Dermed betraktes kokker, spiral, vibrio, trådformede og andre former som tilpasninger til ulike miljøer; Faktisk har spesielle morfologier utviklet seg uavhengig flere ganger, noe som tyder på at bakteriens former kan tilpasses bestemte miljøer ^3,5. Men gjennom bakteriecellens livssyklus endres celleformen, og dette skjer også som en genetisk respons på skadelige miljøforhold³. Bakteriecellenes form og størrelse bestemmer sterkt bakterienes stivhet, robusthet og overflate-til-volum-forhold, og denne egenskapen kan utnyttes for bioteknologiske prosesser⁶.

Elektronisk mikroskopi brukes til å studere biologiske prøver på grunn av den høye forstørrelsen som kan nås utover lysbaserte mikroskoper. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og scanning elektronmikroskopi (SEM) er de mest brukte teknikkene for dette formålet; Imidlertid krever prøver noen behandlinger før de plasseres i mikroskopets kammer for å oppnå passende bilder. Et gulldeksel på prøvene er nødvendig, og tiden som brukes til total bildeinnsamling bør ikke være for lang. I motsetning til dette er atomkraftmikroskopi (AFM) en teknikk som er mye brukt i analysen av overflater, men er også ansatt i studiet av biologiske prøver.

Det finnes flere typer AFM-moduser som brukes i overflateanalyse, for eksempel kontaktmodus, ikke-kontaktmodus eller tapping, magnetisk kraftmikroskopi (MFM), ledende AFM, piezoelektrisk kraftmikroskopi (PFM), peak force tapping (PFT), kontaktresonans og kraftvolum. Hver modus brukes i analysen av materialer og gir forskjellig informasjon om overflaten av materialene og deres mekaniske og fysiske egenskaper. Imidlertid brukes noen AFM-moduser til analyse av biologiske prøver in vitro, for eksempel PFT, fordi PFT tillater å oppnå topografiske og mekaniske data på celler i et flytende medium⁷.

I dette arbeidet brukte vi den mest grunnleggende modusen som er inkludert i hver gammel og enkel AFM-modell – kontaktmodusen. AFM bruker en skarp sonde (rundt <50 nm i diameter) for å skanne områder mindre enn 100 μm. Sonden er justert til prøven for å samhandle med kraftfeltene som er knyttet til prøven. Overflaten skannes med sonden for å holde kraften konstant. Deretter genereres et bilde av overflaten ved å overvåke utkragingens bevegelse når den beveger seg over overflaten. Den innsamlede informasjonen gir overflatenes nanomekaniske egenskaper, for eksempel vedheft, elastisitet, viskositet og skjær.

I AFM-kontaktmodus skannes utkrageren over prøven ved en fast avbøyning. Dette gjør at man kan bestemme høyden på prøvene (Z), og dette representerer en fordel i forhold til de andre elektroniske mikroskopteknikkene. AFM-programvaren tillater generering av en 3D-bildeskanning ved samspillet mellom spissen og prøveoverflaten, og spissavbøyningen er korrelert med prøvens høyde gjennom en laser og en detektor.

I statisk modus (kontaktmodus) med konstant kraft presenterer utgangen to forskjellige bilder: høyden (z-topografien) og avbøyningen eller feilsignalet. Statisk modus er en verdifull, enkel avbildningsmodus, spesielt for robuste prøver i luft som kan håndtere de høye belastningene og vridningskreftene som utøves av statisk modus. Avbøynings- eller feilmodus drives i konstant kraftmodus. Imidlertid forbedres topografibildet ytterligere ved å legge til avbøyningssignalet til overflatestrukturen. I denne modusen blir avbøyningssignalet også referert til som feilsignalet ettersom avbøyningen er tilbakemeldingsparameteren; Eventuelle funksjoner eller morfologi som vises i denne kanalen, skyldes “feilen” i tilbakemeldingssløyfen, eller rettere sagt på grunn av tilbakemeldingssløyfen som kreves for å opprettholde et konstant avbøyningssettpunkt.

AFMs unike design gjør den kompakt – liten nok til å passe på en bordplate – samtidig som den har høy nok oppløsning til å løse atomtrinn. AFM-utstyret har en lavere kostnad enn utstyret til andre elektroniske mikroskoper, og vedlikeholdskostnadene er minimale. Mikroskopet krever ikke et laboratorium med spesielle forhold som et rent rom eller et isolert rom; Den trenger bare et vibrasjonsfritt skrivebord. For AFM trenger prøvene ikke å gjennomgå forseggjort forberedelse som for andre teknikker (gulldeksel, slanking); Bare en tørr prøve må festes til prøveholderen.

Vi bruker AFM-kontaktmodus for å observere bakterielle morfologier og effekten av NP. Populasjonen og cellulær morfologi av bakterier festet på en støtte kan observeres, samt den cellulære skaden som produseres av nanopartikler på bakterieartene. Bildene oppnådd av AFM-kontaktmodus bekrefter at det er et kraftig verktøy og ikke er begrenset av reagenser og kompliserte prosedyrer, noe som gjør det til en enkel, rask og økonomisk metode for bakteriell karakterisering.

Protocol

1. Bakteriell isolasjon og identifikasjon Isolering av en endofytisk stamme fra hvitløkspære meristems:Legg 2 mm fragmenter av meristemer fra tidligere skrellet, desinfisert og kuttet hvitløksløk på trypticase soyaagar (TSA) som et rikt vekstmedium, og rug ved 25 °C i 1 dag. Basert på de morfologiske forskjellene i bakteriekoloniene – form, størrelse, farge, kant, overført lys, reflektert lys, tekstur, konsistens og pigmentproduksjon – beskriver de forskjellige obser…

Representative Results

Bilder av morfologien og størrelsen på S. aureus og P. hunanensis-stammer , samt populasjonsorganisasjonen av begge stammer, ble tatt ved atomkraftmikroskopi i kontaktmodus.  S. aureus-bildene viste at populasjonen var fordelt etter soner med aggregater av kokker (figur 1A). Med en økning i skala var det en større forståelse av populasjonsfordelingen og morfologien til kokkene (figur 1B). Mikroskopirapportene viste at en pseudo-h…

Discussion

Mikroskopi er en teknikk som vanligvis brukes i biologiske laboratorier som muliggjør undersøkelse av struktur, størrelse, morfologi og cellulær arrangement av biologiske prøver. For å forbedre denne teknikken kan flere typer mikroskoper brukes som avviger fra hverandre når det gjelder deres optiske eller elektroniske egenskaper, som bestemmer instrumentets oppløsningskraft.

I vitenskapelig forskning er bruk av mikroskopi nødvendig for karakterisering av bakterieceller; for eksempel h…

Materials

AFM EasyScan 2	NanoSurf	discontinued	Measurement Media
bacteriological loop	No aplica	not applicable	instrument for bacterial inoculation
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix installation kit
Bioedit	not applicable	version 7.2.5	Sequence alignment editor
Cary 60 spectrometer	Agilent Technologies	not applicable
ceftriazone	Merck	not applicable	antibiotic
centrifuge	eppendorf	not applicable	to remove particles that interfere with AFM
ContAI-G Silicon cantilever	BudgetSensors	ContAl-G-10	Measurement Media
eosin and methylene blue agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	bacterial strain
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hinton broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutrient agar	Merck	not applicable	bacterial culture medium
nutritious broth	Merck	not applicable	bacterial culture medium
Petri dishes	not applicable	not applicable	growth of bacteria
Pseudomonas hunanensis 9AP	not applicable	not applicable	isolated from the garlic bulb by CNRG
Sanger sequencing	Macrogen	not applicable	sequencing service
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
slides	not applicable	not applicable	glass holder for bacterial sample analysis
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	ATCC 25923	bacterial strain
Thermalcycler	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR amplification
Trypticasein soy agar	BD	BA-256665	growth media
ultrasonicator	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	not applicable	for mixing the nanoparticle dilutions