Атомно-силовая микроскопия в контактном режиме как быстрый метод морфологического наблюдения и анализа повреждений бактериальных клеток
Summary
Здесь мы представляем применение атомно-силовой микроскопии (АСМ) как простого и быстрого метода характеристики бактерий и анализируем такие детали, как размер и форма бактерий, биопленки бактериальных культур и активность наночастиц в качестве бактерицидов.
Abstract
Электронная микроскопия является одним из инструментов, необходимых для характеристики клеточных структур. Однако процедура сложная и дорогостоящая из-за подготовки образца к наблюдению. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является очень полезным методом определения характеристик из-за ее высокого разрешения в трех измерениях и из-за отсутствия каких-либо требований к проводимости вакуума и образца. АСМ может получать изображения широкого спектра образцов с различной рельефностью и различными типами материалов.
АСМ предоставляет 3D-топографическую информацию высокого разрешения от уровня ангстрема до микронного масштаба. В отличие от традиционной микроскопии, АСМ использует зонд для создания изображения топографии поверхности образца. В этом протоколе предлагается использовать этот тип микроскопии для морфологической характеристики и характеристики повреждений клеток бактерий, закрепленных на носителе. Были использованы штаммы Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) и Pseudomonas hunanensis (выделенные из образцов луковиц чеснока). В этой работе бактериальные клетки были выращены в специфических питательных средах. Для наблюдения за повреждением клеток золотистый стафилококк и кишечная палочка инкубировали с различными концентрациями наночастиц (НУП).
Каплю бактериальной суспензии фиксировали на стеклянной подставке, а снимки делали с помощью АСМ в разных масштабах. Полученные изображения показали морфологические характеристики бактерий. Далее, используя АСМ, можно было наблюдать повреждение клеточной структуры, вызванное действием НУП. На основании полученных изображений контактный АСМ может быть использован для характеристики морфологии бактериальных клеток, закрепленных на носителе. АСМ также является подходящим инструментом для исследования воздействия НП на бактерии. По сравнению с электронной микроскопией, АСМ является недорогим и простым в использовании методом.
Introduction
Различные формы бактерий были впервые отмечены Антони ван Левенгуком в 17 веке1. Бактерии существовали в большом разнообразии форм с древних времен, начиная от сфер и заканчивая ветвящимися клетками2. Форма клеток является фундаментальным условием для бактериальных таксономистов при описании и классификации каждого вида бактерий, главным образом для морфологического разделения грамположительных и грамотрицательных типов3. Известно, что несколько элементов определяют формы бактериальных клеток, все из которых участвуют в клеточных покровах и опорах в качестве компонентов клеточной стенки и мембраны, а также в цитоскелете. Таким образом, ученые все еще выясняют химические, биохимические и физические механизмы и процессы, участвующие в определении форм бактериальных клеток, все из которых определяются кластерами генов, определяющих формы бактерий 2,4.
Кроме того, ученые показали, что форма палочки, вероятно, является предковой формой бактериальных клеток, поскольку эта форма клеток кажется оптимальной по значимым для клеток параметрам. Таким образом, кокки, спирали, вибрионы, нитевидные и другие формы рассматриваются как приспособления к различным средам; Действительно, определенные морфологии развивались независимо несколько раз, предполагая, что формы бактерий могут быть адаптацией к определенным средам 3,5. Однако на протяжении всего жизненного цикла бактериальной клетки форма клетки изменяется, и это также происходит как генетическая реакция на вредные условия окружающей среды3. Форма и размер бактериальных клеток в значительной степени определяют жесткость, прочность и отношение поверхности к объему бактерий, и эта характеристика может быть использована для биотехнологических процессов6.
Электронная микроскопия используется для изучения биологических образцов из-за большого увеличения, которое может быть достигнуто за пределами световых микроскопов. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) являются наиболее часто используемыми методами для этой цели; Тем не менее, образцы требуют некоторой обработки, прежде чем они будут помещены в камеру микроскопа для получения соответствующих изображений. На образцах требуется золотая крышка, а время, затрачиваемое на полное получение изображения, не должно быть слишком большим. Напротив, атомно-силовая микроскопия (АСМ) является методом, широко используемым при анализе поверхностей, но также используется при изучении биологических образцов.
Существует несколько типов режимов АСМ, используемых при анализе поверхности, таких как контактный режим, бесконтактный режим или постукивание, магнитно-силовая микроскопия (MFM), проводящая АСМ, пьезоэлектрическая силовая микроскопия (PFM), пиковая силовая резьба (PFT), контактный резонанс и объем силы. Каждый режим используется при анализе материалов и предоставляет различную информацию о поверхности материалов и их механических и физических свойствах. Тем не менее, некоторые режимы АСМ используются для анализа биологических образцов in vitro, такие как ПФТ, поскольку ПФТ позволяет получать топографические и механические данные о клетках в жидкой среде7.
В этой работе мы использовали самый основной режим, входящий в каждую старую и простую модель АСМ – контактный режим. АСМ использует острый зонд (диаметром около <50 нм) для сканирования областей менее 100 мкм. Зонд выравнивается по образцу, чтобы взаимодействовать с силовыми полями, связанными с образцом. Поверхность сканируется с помощью зонда, чтобы поддерживать постоянную силу. Затем изображение поверхности генерируется путем наблюдения за движением кантилевера при его движении по поверхности. Собранная информация обеспечивает наномеханические свойства поверхности, такие как адгезия, эластичность, вязкость и сдвиг.
В контактном режиме АСМ кантилевер сканируется поперек образца с фиксированным отклонением. Это позволяет определить высоту образцов (Z), и это представляет собой преимущество по сравнению с другими методами электронного микроскопа. Программное обеспечение AFM позволяет генерировать сканирование 3D-изображения за счет взаимодействия между наконечником и поверхностью образца, а отклонение наконечника коррелирует с высотой образца с помощью лазера и детектора.
В статическом режиме (контактный режим) с постоянной силой на выходе отображаются два разных изображения: высота (z-топография) и сигнал отклонения или ошибки. Статический режим является ценным и простым режимом визуализации, особенно для прочных образцов в воздухе, которые могут выдерживать высокие нагрузки и крутильные силы, оказываемые статическим режимом. Режим отклонения или ошибки работает в режиме постоянной силы. Тем не менее, топографическое изображение дополнительно улучшается за счет добавления сигнала отклонения к структуре поверхности. В этом режиме сигнал отклонения также называется сигналом ошибки, поскольку отклонение является параметром обратной связи; Любые особенности или морфология, которые появляются в этом канале, обусловлены «ошибкой» в петле обратной связи или, скорее, петлей обратной связи, необходимой для поддержания постоянного заданного значения отклонения.
Уникальная конструкция АСМ делает его компактным – достаточно маленьким, чтобы поместиться на столешнице, – а также имеет достаточно высокое разрешение для разрешения атомарных шагов. Оборудование АСМ имеет меньшую стоимость, чем оборудование для других электронных микроскопов, а затраты на обслуживание минимальны. Микроскоп не требует лаборатории с особыми условиями, такими как чистая комната или изолированное пространство; Ему нужен только стол без вибрации. Для АСМ образцы не нуждаются в сложной подготовке, как при других методах (золотое покрытие, похудение); К держателю образца должен быть прикреплен только сухой образец.
Мы используем контактный режим AFM для наблюдения за морфологией бактерий и воздействием НУП. Можно наблюдать популяцию и клеточную морфологию бактерий, закрепленных на носителе, а также клеточное повреждение, вызванное наночастицами на видах бактерий. Изображения, полученные в контактном режиме АСМ, подтверждают, что это мощный инструмент и не ограничен реагентами и сложными процедурами, что делает его простым, быстрым и экономичным методом характеристики бактерий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроскопия — это метод, обычно используемый в биологических лабораториях, который позволяет исследовать структуру, размер, морфологию и клеточное расположение биологических образцов. Для совершенствования этой методики можно использовать несколько типов микроскопов, отличающихся…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Рамиро Мунис-Диас благодарит CONACyT за стипендию.
Materials
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
Riferimenti
- Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
- Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367 (2015).
- Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology. Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).
- Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. Bacterial cell shape. Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).
- Smith, W. P., et al. Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).
- Volke, D. C., Nikel, P. I. Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories. Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).
- Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology. Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).
- Hoffman, C. S., Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).
- Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
- Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).
- Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure. Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stackebrandt, E., Ebers, J. Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards. Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).
- Muñiz Diaz, R., et al. Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria. Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).
- Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).
- Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods. 42 (4), 321-324 (2007).
- Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).
- Yamada, S., et al. autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).
- Zuttion, F., et al. The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy. Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).
- Kahli, H., et al. Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).
- Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations. World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).
- Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents. Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).
- Lee, H. -. E., et al. NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains. Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).
- Song, L. Y., et al. Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food. Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).
- Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock. Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).
- Shar, S. S., et al. Biomineralization of platinum by Escherichia coli. Metals. 9 (4), 407 (2019).
- Baidamshina, D., et al. Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease. Scientific Reports. 7, 46068 (2017).
- Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).
