Microscopía de fuerza atómica en modo de contacto como técnica rápida para la observación morfológica y el análisis del daño celular bacteriano
Summary
Aquí, presentamos la aplicación de la microscopía de fuerza atómica (AFM) como un método simple y rápido para la caracterización bacteriana y analizamos detalles como el tamaño y la forma bacteriana, las biopelículas de cultivo bacteriano y la actividad de las nanopartículas como bactericidas.
Abstract
La microscopía electrónica es una de las herramientas necesarias para caracterizar las estructuras celulares. Sin embargo, el procedimiento es complicado y costoso debido a la preparación de la muestra para la observación. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica de caracterización muy útil debido a su alta resolución en tres dimensiones y debido a la ausencia de cualquier requisito de vacío y conductividad de la muestra. AFM puede obtener imágenes de una amplia variedad de muestras con diferentes topografías y diferentes tipos de materiales.
AFM proporciona información topográfica 3D de alta resolución desde el nivel angstrom hasta la escala de micras. A diferencia de la microscopía tradicional, AFM utiliza una sonda para generar una imagen de la topografía de la superficie de una muestra. En este protocolo, se sugiere el uso de este tipo de microscopía para la caracterización morfológica y de daños celulares de bacterias fijadas en un soporte. Se utilizaron cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomonas hunanensis (aislada de muestras de bulbo de ajo). En este trabajo, las células bacterianas se cultivaron en medios de cultivo específicos. Para observar el daño celular, Staphylococcus aureus y Escherichia coli se incubaron con diferentes concentraciones de nanopartículas (NP).
Se fijó una gota de suspensión bacteriana en un soporte de vidrio, y se tomaron imágenes con AFM a diferentes escalas. Las imágenes obtenidas mostraron las características morfológicas de las bacterias. Además, empleando AFM, fue posible observar el daño a la estructura celular causado por el efecto de las NPs. A partir de las imágenes obtenidas, la AFM de contacto se puede utilizar para caracterizar la morfología de las células bacterianas fijadas en un soporte. AFM también es una herramienta adecuada para la investigación de los efectos de las NP en las bacterias. En comparación con la microscopía electrónica, AFM es una técnica económica y fácil de usar.
Introduction
Diferentes formas bacterianas fueron observadas por primera vez por Antony van Leeuwenhoek en el siglo 171. Las bacterias han existido en una gran diversidad de formas desde la antigüedad, que van desde esferas hasta células ramificadas2. La forma celular es una condición fundamental para que los taxónomos bacterianos describan y clasifiquen cada especie bacteriana, principalmente para la separación morfológica de filos grampositivos y gramnegativos3. Se sabe que varios elementos determinan las formas celulares bacterianas, todos los cuales están involucrados en las cubiertas y el soporte celular como componentes de la pared celular y la membrana, así como en el citoesqueleto. De esta manera, los científicos todavía están dilucidando los mecanismos y procesos químicos, bioquímicos y físicos implicados en la determinación de las formas celulares bacterianas, todos los cuales están definidos por grupos de genes que definen las formas bacterianas 2,4.
Además, los científicos han demostrado que la forma de bastón es probablemente la forma ancestral de las células bacterianas, ya que esta forma de célula parece óptima en parámetros significativos para las células. Por lo tanto, los cocos, la espiral, el vibrio, las formas filamentosas y otras se consideran adaptaciones a diversos entornos; De hecho, morfologías particulares han evolucionado independientemente varias veces, lo que sugiere que las formas de las bacterias podrían ser adaptaciones a ambientes particulares 3,5. Sin embargo, a lo largo del ciclo de vida de la célula bacteriana, la forma de la célula cambia, y esto también ocurre como una respuesta genética a condiciones ambientales dañinas3. La forma y el tamaño de la célula bacteriana determinan fuertemente la rigidez, robustez y relación superficie-volumen de las bacterias, y esta característica puede ser explotada para procesos biotecnológicos6.
La microscopía electrónica se utiliza para estudiar muestras biológicas debido al alto aumento que se puede alcanzar más allá de los microscopios basados en la luz. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la microscopía electrónica de barrido (SEM) son las técnicas más utilizadas para este propósito; Sin embargo, las muestras requieren algunos tratamientos antes de ser colocadas en la cámara del microscopio con el fin de obtener imágenes apropiadas. Se requiere una cubierta de oro en las muestras, y el tiempo utilizado para la adquisición total de imágenes no debe ser demasiado largo. Por el contrario, la microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica ampliamente utilizada en el análisis de superficies, pero también se emplea en el estudio de muestras biológicas.
Existen varios tipos de modos AFM utilizados en el análisis de superficies, como el modo de contacto, el modo sin contacto o roscado, la microscopía de fuerza magnética (MFM), la AFM conductiva, la microscopía de fuerza piezoeléctrica (PFM), el roscado de fuerza máxima (PFT), la resonancia de contacto y el volumen de fuerza. Cada modo se utiliza en el análisis de materiales y proporciona información diferente sobre la superficie de los materiales y sus propiedades mecánicas y físicas. Sin embargo, algunos modos AFM se utilizan para el análisis de muestras biológicas in vitro, como PFT, porque PFT permite obtener datos topográficos y mecánicos sobre células en un medio líquido7.
En este trabajo, utilizamos el modo más básico incluido en cada modelo AFM antiguo y simple: el modo de contacto. AFM utiliza una sonda nítida (alrededor de <50 nm de diámetro) para escanear áreas de menos de 100 μm. La sonda se alinea con la muestra para interactuar con los campos de fuerza asociados con la muestra. La superficie se escanea con la sonda para mantener la fuerza constante. Luego, se genera una imagen de la superficie monitoreando el movimiento del voladizo a medida que se mueve a través de la superficie. La información recopilada proporciona las propiedades nanomecánicas de la superficie, como la adhesión, la elasticidad, la viscosidad y el cizallamiento.
En el modo de contacto AFM, el voladizo se escanea a través de la muestra con una desviación fija. Esto permite determinar la altura de las muestras (Z), y esto representa una ventaja sobre las otras técnicas de microscopio electrónico. El software AFM permite la generación de un escaneo de imagen 3D por la interacción entre la punta y la superficie de la muestra, y la desviación de la punta se correlaciona con la altura de la muestra a través de un láser y un detector.
En modo estático (modo de contacto) con fuerza constante, la salida presenta dos imágenes diferentes: la altura (topografía z) y la señal de deflexión o error. El modo estático es un modo de imagen valioso y simple, especialmente para muestras robustas en el aire que pueden manejar las altas cargas y las fuerzas de torsión ejercidas por el modo estático. El modo de deflexión o error se opera en modo de fuerza constante. Sin embargo, la imagen de la topografía se mejora aún más al agregar la señal de desviación a la estructura de la superficie. En este modo, la señal de deflexión también se conoce como señal de error, ya que la desviación es el parámetro de retroalimentación; Cualquier característica o morfología que aparezca en este canal se debe al “error” en el bucle de retroalimentación o, más bien, debido al bucle de retroalimentación requerido para mantener un punto de ajuste de deflexión constante.
El diseño único de AFM lo hace compacto, lo suficientemente pequeño como para caber en una mesa, al tiempo que tiene una resolución lo suficientemente alta como para resolver los pasos atómicos. El equipo AFM tiene un costo menor que el equipo para otros microscopios electrónicos, y los costos de mantenimiento son mínimos. El microscopio no requiere un laboratorio con condiciones especiales como una sala limpia o un espacio aislado; Solo necesita un escritorio libre de vibraciones. Para AFM, las muestras no necesitan someterse a una preparación elaborada como para otras técnicas (cubierta de oro, adelgazamiento); Solo se debe adjuntar una muestra seca al portamuestras.
Utilizamos el modo de contacto AFM para observar las morfologías bacterianas y los efectos de las NP. Se puede observar la población y la morfología celular de las bacterias fijadas en un soporte, así como el daño celular producido por las nanopartículas sobre las especies bacterianas. Las imágenes obtenidas por el modo de contacto AFM confirman que es una herramienta poderosa y no está limitada por reactivos y procedimientos complicados, por lo que es un método simple, rápido y económico para la caracterización bacteriana.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopía es una técnica comúnmente utilizada en laboratorios biológicos que permite la investigación de la estructura, tamaño, morfología y disposición celular de muestras biológicas. Para mejorar esta técnica, se pueden utilizar varios tipos de microscopios que difieren entre sí en cuanto a sus características ópticas o electrónicas, que determinan la potencia de resolución del instrumento.
En la investigación científica, se requiere el uso de microscopía para la carac…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ramiro Muñiz-Díaz agradece al CONACyT por la beca.
Materials
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
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