Kontaktläge Atomkraftsmikroskopi som en snabb teknik för morfologisk observation och bakteriell cellskadeanalys
Summary
Här presenterar vi tillämpningen av atomkraftmikroskopi (AFM) som en enkel och snabb metod för bakteriell karakterisering och analyserar detaljer som bakteriestorlek och form, bakteriekulturbiofilmer och nanopartiklars aktivitet som bakteriedödande medel.
Abstract
Elektronmikroskopi är ett av de verktyg som krävs för att karakterisera cellulära strukturer. Förfarandet är emellertid komplicerat och dyrt på grund av provberedningen för observation. Atomkraftmikroskopi (AFM) är en mycket användbar karakteriseringsteknik på grund av dess höga upplösning i tre dimensioner och på grund av avsaknaden av krav på vakuum och provledningsförmåga. AFM kan avbilda en mängd olika prover med olika topografier och olika typer av material.
AFM ger högupplöst 3D-topografiinformation från ångströmnivå till mikronskala. Till skillnad från traditionell mikroskopi använder AFM en sond för att generera en bild av yttopografin i ett prov. I detta protokoll föreslås användningen av denna typ av mikroskopi för morfologisk och cellskada karakterisering av bakterier fixerade på ett stöd. Stammar av Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) och Pseudomonas hunanensis (isolerade från vitlökslökprover) användes. I detta arbete odlades bakterieceller i specifika odlingsmedier. För att observera cellskador inkuberades Staphylococcus aureus och Escherichia coli med olika koncentrationer av nanopartiklar (NP).
En droppe bakteriesuspension fixerades på ett glasstöd, och bilder togs med AFM i olika skalor. De erhållna bilderna visade bakteriens morfologiska egenskaper. Vidare, med hjälp av AFM, var det möjligt att observera skadorna på den cellulära strukturen orsakad av effekten av NP. Baserat på de erhållna bilderna kan kontakt-AFM användas för att karakterisera morfologin hos bakterieceller fixerade på ett stöd. AFM är också ett lämpligt verktyg för undersökning av effekterna av NP på bakterier. Jämfört med elektronmikroskopi är AFM en billig och lättanvänd teknik.
Introduction
Olika bakterieformer noterades först av Antony van Leeuwenhoek på 17-talet1. Bakterier har funnits i en stor mångfald av former sedan antiken, allt från sfärer till förgreningsceller2. Cellform är ett grundläggande villkor för bakteriella taxonomer att beskriva och klassificera varje bakterieart, främst för morfologisk separation av gram-positiv och gramnegativ phyla3. Flera element är kända för att bestämma bakteriella cellformer, som alla är involverade i cellöverdrag och stöd som komponenter i cellväggen och membranet, liksom i cytoskelettet. På detta sätt belyser forskare fortfarande de kemiska, biokemiska och fysiska mekanismer och processer som är inblandade i att bestämma bakteriella cellformer, som alla definieras av kluster av gener som definierar bakterieformer 2,4.
Dessutom har forskare visat att stavformen sannolikt är den förfäderliga formen av bakterieceller, eftersom denna cellform verkar optimal i cellsignifikanta parametrar. Således betraktas kocker, spiral, vibrio, filamentösa och andra former som anpassningar till olika miljöer; Faktum är att vissa morfologier har utvecklats oberoende flera gånger, vilket tyder på att bakteriernas former kan anpassas till särskilda miljöer 3,5. Men under hela bakteriecellens livscykel förändras cellformen, och detta sker också som ett genetiskt svar på skadliga miljöförhållanden3. Bakteriecellens form och storlek bestämmer starkt bakteriens styvhet, robusthet och förhållande mellan yta och volym, och denna egenskap kan utnyttjas för biotekniska processer6.
Elektronisk mikroskopi används för att studera biologiska prover på grund av den höga förstoringen som kan nås bortom ljusbaserade mikroskop. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) och svepelektronmikroskopi (SEM) är de vanligaste teknikerna för detta ändamål; Prover kräver dock vissa behandlingar innan de placeras i mikroskopets kammare för att få lämpliga bilder. Ett guldskydd på proverna krävs, och den tid som används för total bildförvärv bör inte vara för lång. Däremot är atomkraftmikroskopi (AFM) en teknik som ofta används vid analys av ytor men används också vid studier av biologiska prover.
Det finns flera typer av AFM-lägen som används vid ytanalys, såsom kontaktläge, beröringsfritt läge eller tappning, magnetisk kraftmikroskopi (MFM), ledande AFM, piezoelektrisk kraftmikroskopi (PFM), toppkrafttappning (PFT), kontaktresonans och kraftvolym. Varje läge används vid analys av material och ger olika information om materialens yta och deras mekaniska och fysikaliska egenskaper. Vissa AFM-lägen används emellertid för analys av biologiska prover in vitro, såsom PFT, eftersom PFT möjliggör erhållande av topografiska och mekaniska data om celler i ett flytande medium7.
I det här arbetet använde vi det mest grundläggande läget som ingår i varje gammal och enkel AFM-modell – kontaktläget. AFM använder en skarp sond (cirka <50 nm i diameter) för att skanna områden mindre än 100 μm. Sonden justeras mot provet för att interagera med kraftfälten som är associerade med provet. Ytan skannas med sonden för att hålla kraften konstant. Därefter genereras en bild av ytan genom att övervaka utskjutarens rörelse när den rör sig över ytan. Den insamlade informationen ger ytans nanomekaniska egenskaper, såsom vidhäftning, elasticitet, viskositet och skjuvning.
I AFM-kontaktläget skannas utskjutaren över provet med en fast avböjning. Detta gör att man kan bestämma höjden på proverna (Z), och detta utgör en fördel jämfört med de andra elektroniska mikroskopteknikerna. AFM-programvaran möjliggör generering av en 3D-bildskanning genom interaktionen mellan spetsen och provytan, och spetsböjningen är korrelerad med provets höjd genom en laser och en detektor.
I statiskt läge (kontaktläge) med konstant kraft presenterar utgången två olika bilder: höjden (z-topografi) och avböjnings- eller felsignalen. Statiskt läge är ett värdefullt, enkelt bildläge, särskilt för robusta prover i luft som kan hantera de höga belastningar och vridkrafter som utövas av statiskt läge. Avböjnings- eller felläget drivs i konstant kraftläge. Topografibilden förbättras dock ytterligare genom att avböjningssignalen läggs till ytstrukturen. I detta läge kallas avböjningssignalen också felsignalen eftersom avböjningen är återkopplingsparametern; Alla funktioner eller morfologi som visas i den här kanalen beror på “felet” i återkopplingsslingan eller snarare på grund av återkopplingsslingan som krävs för att upprätthålla ett konstant avböjningsbörvärde.
AFM: s unika design gör den kompakt – tillräckligt liten för att passa på en bordsskiva – samtidigt som den har tillräckligt hög upplösning för att lösa atomsteg. AFM-utrustningen har en lägre kostnad än utrustningen för andra elektroniska mikroskop, och underhållskostnaderna är minimala. Mikroskopet kräver inte ett laboratorium med speciella förhållanden som ett renrum eller ett isolerat utrymme; Det behöver bara ett vibrationsfritt skrivbord. För AFM behöver proverna inte genomgå en detaljerad beredning som för andra tekniker (guldöverdrag, bantning); Endast ett torrt prov behöver fästas på provhållaren.
Vi använder AFM-kontaktläge för att observera bakteriella morfologier och effekterna av NP. Populationen och cellulär morfologi hos bakterier fixerade på ett stöd kan observeras, liksom den cellulära skada som produceras av nanopartiklar på bakteriearten. Bilderna som erhållits med AFM-kontaktläge bekräftar att det är ett kraftfullt verktyg och inte begränsas av reagens och komplicerade procedurer, vilket gör det till en enkel, snabb och ekonomisk metod för bakteriell karakterisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroskopi är en teknik som vanligtvis används i biologiska laboratorier som möjliggör undersökning av struktur, storlek, morfologi och cellulärt arrangemang av biologiska prover. För att förbättra denna teknik kan flera typer av mikroskop användas som skiljer sig från varandra när det gäller deras optiska eller elektroniska egenskaper, som bestämmer instrumentets upplösningseffekt.
I vetenskaplig forskning krävs användning av mikroskopi för karakterisering av bakterieceller;…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ramiro Muniz-Diaz tackar CONACyT för stipendiet.
Materials
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
Riferimenti
- Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
- Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367 (2015).
- Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology. Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).
- Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. Bacterial cell shape. Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).
- Smith, W. P., et al. Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).
- Volke, D. C., Nikel, P. I. Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories. Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).
- Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology. Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).
- Hoffman, C. S., Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).
- Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
- Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).
- Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure. Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stackebrandt, E., Ebers, J. Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards. Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).
- Muñiz Diaz, R., et al. Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria. Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).
- Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).
- Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods. 42 (4), 321-324 (2007).
- Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).
- Yamada, S., et al. autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).
- Zuttion, F., et al. The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy. Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).
- Kahli, H., et al. Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).
- Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations. World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).
- Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents. Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).
- Lee, H. -. E., et al. NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains. Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).
- Song, L. Y., et al. Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food. Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).
- Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock. Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).
- Shar, S. S., et al. Biomineralization of platinum by Escherichia coli. Metals. 9 (4), 407 (2019).
- Baidamshina, D., et al. Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease. Scientific Reports. 7, 46068 (2017).
- Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).
