Morfolojik Gözlem ve Bakteriyel Hücre Hasar Analizi için Hızlı Bir Teknik Olarak Temas Modu Atomik Kuvvet Mikroskobu
Summary
Burada, atomik kuvvet mikroskobunun (AFM) bakteriyel karakterizasyonu için basit ve hızlı bir yöntem olarak uygulanmasını sunuyoruz ve bakteri boyutu ve şekli, bakteri kültürü biyofilmleri ve nanopartiküllerin bakterisitler olarak aktivitesi gibi ayrıntıları analiz ediyoruz.
Abstract
Elektron mikroskobu, hücresel yapıları karakterize etmek için gerekli araçlardan biridir. Bununla birlikte, gözlem için numune hazırlama nedeniyle prosedür karmaşık ve pahalıdır. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), üç boyutlu yüksek çözünürlüğü ve vakum ve numune iletkenliği için herhangi bir gereksinimin bulunmaması nedeniyle çok kullanışlı bir karakterizasyon tekniğidir. AFM, farklı topografyalara ve farklı malzeme türlerine sahip çok çeşitli örnekleri görüntüleyebilir.
AFM, angstrom seviyesinden mikron ölçeğine kadar yüksek çözünürlüklü 3D topografya bilgileri sağlar. Geleneksel mikroskopiden farklı olarak, AFM bir numunenin yüzey topografyasının görüntüsünü oluşturmak için bir prob kullanır. Bu protokolde, bir destek üzerine sabitlenmiş bakterilerin morfolojik ve hücre hasarı karakterizasyonu için bu tip mikroskopinin kullanılması önerilmektedir. Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) ve Pseudomonas hunanensis (sarımsak ampulü örneklerinden izole edilmiş) suşları kullanıldı. Bu çalışmada, bakteri hücreleri belirli kültür ortamlarında yetiştirildi. Hücre hasarını gözlemlemek için, Staphylococcus aureus ve Escherichia coli , farklı konsantrasyonlarda nanopartiküller (NP’ler) ile inkübe edildi.
Bir cam destek üzerine bir damla bakteri süspansiyonu sabitlendi ve görüntüler AFM ile farklı ölçeklerde çekildi. Elde edilen görüntüler bakterilerin morfolojik özelliklerini göstermiştir. Ayrıca, AFM’yi kullanarak, NP’lerin etkisinin neden olduğu hücresel yapıdaki hasarı gözlemlemek mümkündü. elde edilen görüntülere dayanarak, bir destek üzerine sabitlenmiş bakteri hücrelerinin morfolojisini karakterize etmek için AFM ile temas kullanılabilir. AFM ayrıca NP’lerin bakteriler üzerindeki etkilerinin araştırılması için uygun bir araçtır. Elektron mikroskobu ile karşılaştırıldığında, AFM ucuz ve kullanımı kolay bir tekniktir.
Introduction
Farklı bakteri şekilleri ilk olarak 17. yüzyılda Antony van Leeuwenhoek tarafından kaydedilmiştir1. Bakteriler, antik çağlardan beri, kürelerden dallanan hücrelere kadar çok çeşitli şekillerde var olmuşlardır2. Hücre şekli, bakteriyel taksonomistlerin her bir bakteri türünü tanımlaması ve sınıflandırması için, esas olarak gram-pozitif ve gram-negatif filum3’ün morfolojik olarak ayrılması için temel bir koşuldur. Bakteriyel hücre formlarını belirlediği bilinen çeşitli elementler, bunların hepsi hücre kapaklarında yer alır ve hücre duvarının ve zarının bileşenleri olarak ve ayrıca hücre iskeletinde desteklenir. Bu şekilde, bilim adamları hala bakteriyel hücre formlarının belirlenmesinde rol oynayan kimyasal, biyokimyasal ve fiziksel mekanizmaları ve süreçleri aydınlatmaktadır; bunların hepsi bakteriyel şekilleri tanımlayan gen kümeleri tarafından tanımlanmaktadır 2,4.
Ek olarak, bilim adamları, çubuk şeklinin muhtemelen bakteri hücrelerinin atasal formu olduğunu göstermiştir, çünkü bu hücre şekli hücre açısından önemli parametrelerde en uygun görünmektedir. Bu nedenle, koklar, spiral, vibrio, filamentli ve diğer formlar çeşitli ortamlara adaptasyonlar olarak kabul edilir; Gerçekten de, belirli morfolojiler bağımsız olarak birçok kez evrimleşmiştir, bu da bakteri şekillerinin belirli ortamlara adaptasyonlar olabileceğini düşündürmektedir 3,5. Bununla birlikte, bakteriyel hücre yaşam döngüsü boyunca, hücre şekli değişir ve bu aynı zamanda zararlı çevresel koşullara karşı genetik bir yanıt olarak da ortaya çıkar3. Bakteri hücresi şekli ve boyutu, bakterilerin sertliğini, sağlamlığını ve yüzey-hacim oranını güçlü bir şekilde belirler ve bu özellik biyoteknolojik işlemler için kullanılabilir6.
Elektronik mikroskopi, ışık bazlı mikroskopların ötesine ulaşılabilen yüksek büyütme nedeniyle biyolojik örnekleri incelemek için kullanılır. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) bu amaçla en sık kullanılan tekniklerdir; Bununla birlikte, numuneler uygun görüntüleri elde etmek için mikroskop odasına yerleştirilmeden önce bazı tedaviler gerektirir. Numuneler üzerinde altın bir kapak gereklidir ve toplam görüntü elde etmek için kullanılan süre çok uzun olmamalıdır. Buna karşılık, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), yüzeylerin analizinde yaygın olarak kullanılan bir tekniktir, ancak biyolojik örneklerin incelenmesinde de kullanılmaktadır.
Yüzey analizinde kullanılan temas modu, temassız mod veya kılavuz çekme, manyetik kuvvet mikroskobu (MFM), iletken AFM, piezoelektrik kuvvet mikroskobu (PFM), tepe kuvveti kılavuz çekme (PFT), temas rezonansı ve kuvvet hacmi gibi çeşitli AFM modları vardır. Her mod, malzemelerin analizinde kullanılır ve malzemelerin yüzeyi ve mekanik ve fiziksel özellikleri hakkında farklı bilgiler sağlar. Bununla birlikte, PFT gibi biyolojik örneklerin in vitro analizi için bazı AFM modları kullanılır, çünkü PFT, sıvı bir ortamdaki hücreler hakkında topografik ve mekanik verilerin elde edilmesine izin verir7.
Bu çalışmada, her eski ve basit AFM modelinde bulunan en temel modu kullandık – temas modu. AFM, 100 μm’den küçük alanları taramak için keskin bir prob (yaklaşık <50 nm çapında) kullanır. Prob, numuneyle ilişkili kuvvet alanlarıyla etkileşime girmek için numuneye hizalanır. Kuvveti sabit tutmak için yüzey prob ile taranır. Daha sonra, konsol yüzey boyunca hareket ederken hareketinin izlenmesiyle yüzeyin bir görüntüsü oluşturulur. Toplanan bilgiler, yüzeyin yapışma, elastikiyet, viskozite ve kesme gibi nano-mekanik özelliklerini sağlar.
AFM temas modunda, konsol numune boyunca sabit bir sapmada taranır. Bu, numunelerin yüksekliğini (Z) belirlemeye izin verir ve bu, diğer elektronik mikroskop tekniklerine göre bir avantajı temsil eder. AFM yazılımı, uç ve numune yüzeyi arasındaki etkileşimle bir 3D görüntü taramasının oluşturulmasına izin verir ve uç sapması, bir lazer ve dedektör aracılığıyla numunenin yüksekliği ile ilişkilendirilir.
Sabit kuvvetle statik modda (temas modu), çıkış iki farklı görüntü sunar: yükseklik (z topografyası) ve sapma veya hata sinyali. Statik mod, özellikle statik modun uyguladığı yüksek yükleri ve burulma kuvvetlerini kaldırabilen havadaki sağlam numuneler için değerli, basit bir görüntüleme modudur. Sapma veya hata modu sabit kuvvet modunda çalıştırılır. Bununla birlikte, topografya görüntüsü, yüzey yapısına sapma sinyali eklenerek daha da geliştirilmiştir. Bu modda, sapma sinyali, sapma geri besleme parametresi olduğu için hata sinyali olarak da adlandırılır; Bu kanalda görünen herhangi bir özellik veya morfoloji, geri besleme döngüsündeki “hata” dan veya daha doğrusu, sabit bir sapma ayar noktasını korumak için gereken geri besleme döngüsünden kaynaklanmaktadır.
AFM’nin benzersiz tasarımı, onu kompakt hale getirir – bir masa üstüne sığacak kadar küçük – aynı zamanda atomik adımları çözmek için yeterince yüksek çözünürlüğe sahiptir. AFM ekipmanı, diğer elektronik mikroskoplar için ekipmandan daha düşük bir maliyete sahiptir ve bakım maliyetleri minimumdur. Mikroskop, temiz oda veya izole edilmiş bir alan gibi özel koşullara sahip bir laboratuvar gerektirmez; sadece titreşimsiz bir masaya ihtiyaç duyar. AFM için, numunelerin diğer tekniklerde (altın örtü, zayıflama) olduğu gibi ayrıntılı bir hazırlıktan geçmesi gerekmez; numune tutucuya sadece kuru bir numune takılmalıdır.
Bakteriyel morfolojileri ve NP’lerin etkilerini gözlemlemek için AFM temas modunu kullanıyoruz. Bir desteğe sabitlenmiş bakterilerin popülasyonu ve hücresel morfolojisinin yanı sıra nanopartiküllerin bakteri türleri üzerinde ürettiği hücresel hasar da gözlemlenebilir. AFM temas modu ile elde edilen görüntüler, güçlü bir araç olduğunu ve reaktifler ve karmaşık prosedürlerle sınırlı olmadığını doğrulayarak, bakteriyel karakterizasyon için basit, hızlı ve ekonomik bir yöntem haline getirmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroskopi, biyolojik laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan ve biyolojik örneklerin yapısının, boyutunun, morfolojisinin ve hücresel düzenlemesinin araştırılmasına izin veren bir tekniktir. Bu tekniği geliştirmek için, cihazın çözünürlük gücünü belirleyen optik veya elektronik özellikleri bakımından birbirinden farklı çeşitli mikroskop türleri kullanılabilir.
Bilimsel araştırmalarda, bakteri hücrelerinin karakterizasyonu için mikroskopi kullanımı gerek…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ramiro Muniz-Diaz, burs için CONACyT’ye teşekkür eder.
Materials
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
Riferimenti
- Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
- Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367 (2015).
- Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology. Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).
- Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. Bacterial cell shape. Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).
- Smith, W. P., et al. Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).
- Volke, D. C., Nikel, P. I. Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories. Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).
- Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology. Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).
- Hoffman, C. S., Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).
- Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
- Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).
- Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure. Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stackebrandt, E., Ebers, J. Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards. Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).
- Muñiz Diaz, R., et al. Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria. Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).
- Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).
- Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods. 42 (4), 321-324 (2007).
- Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).
- Yamada, S., et al. autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).
- Zuttion, F., et al. The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy. Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).
- Kahli, H., et al. Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).
- Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations. World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).
- Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents. Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).
- Lee, H. -. E., et al. NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains. Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).
- Song, L. Y., et al. Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food. Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).
- Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock. Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).
- Shar, S. S., et al. Biomineralization of platinum by Escherichia coli. Metals. 9 (4), 407 (2019).
- Baidamshina, D., et al. Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease. Scientific Reports. 7, 46068 (2017).
- Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).
