Gelatine Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, en 3D Bioprinting
Summary
Dit artikel beschrijft protocollen voor high-throughput gelatine methacryloyl microgel fabricage met behulp van microfluïdische apparaten, het omzetten van microgels in resususpensable poeder (micro-aerogels), de chemische assemblage van microgels om granulaire hydrogel scaffolds te vormen, en het ontwikkelen van granulaire hydrogel bioinks met behoud van microporositeit voor 3D bioprinting.
Abstract
De opkomst van granulaire hydrogelsteigers (GHS), vervaardigd via het assembleren van hydrogelmicrodeeltjes (HMP’s), heeft microporeuze steigervorming in situ mogelijk gemaakt. In tegenstelling tot conventionele bulkhydrogels, vergemakkelijken onderling verbonden poriën op microschaal in GHS degradatie-onafhankelijke celinfiltratie en overdracht van zuurstof, voedingsstoffen en cellulaire bijproducten. Methacryloyl-gemodificeerde gelatine (GelMA), een (foto)chemisch crosslinkable, op eiwitten gebaseerd biopolymeer dat cellijm en biologisch afbreekbare stoffen bevat, is op grote schaal gebruikt als een celresponsief / instructief biomateriaal. Het omzetten van bulk GelMA naar GHS kan een overvloed aan mogelijkheden bieden voor tissue engineering en regeneratie. In dit artikel demonstreren we de procedures van high-throughput GelMA microgel fabricage, conversie naar resususdable droge microgels (micro-aerogels), GHS-vorming via de chemische assemblage van microgels en granulaire bioinkfabricage voor extrusie bioprinting. We laten zien hoe een sequentiële fysisch-chemische behandeling via koeling en fotocrosslinking de vorming van mechanisch robuust GHS mogelijk maakt. Wanneer licht ontoegankelijk is (bijvoorbeeld tijdens diepe weefselinjectie), kunnen individueel verknoopte GelMA HMP’s bioorthogonaal worden geassembleerd via enzymatische crosslinking met behulp van transglutaminasen. Ten slotte wordt driedimensionaal (3D) bioprinten van microporeus GHS bij lage HMP-verpakkingsdichtheid gedemonstreerd via de interfaciale zelfassemblage van heterogeen geladen nanodeeltjes.
Introduction
Het assembleren van HMP-bouwstenen om tissue engineering-steigers te vormen heeft de afgelopen jaren enorm veel aandacht gekregen1. GHS, vervaardigd via HMP-assemblage, heeft unieke eigenschappen in vergelijking met hun bulktegenhangers, waaronder microporositeit op celschaal afkomstig van de lege ruimtes tussen de discrete bouwstenen. Bijkomende eigenschappen, zoals injecteerbaarheid, modulariteit en ontkoppelde stijfheid van porositeit, maken GHS een veelbelovend platform om weefselherstel en regeneratie te verbeteren2. Verschillende biomaterialen zijn gebruikt voor ghs-fabricage, waaronder synthetische peg-gebaseerde polymeren3,4 en polysacchariden, zoals alginaat5 en hyaluronzuur 6,7. Onder natuurlijk afgeleide polymeren is het meest voorkomende op eiwitten gebaseerde biopolymeer voor GHS-fabricage GelMA 8,9,10,11, een crosslinkable, biocompatibele, bioadhesieve en biologisch afbreekbare biomateriaal 12,13.
HMP’s kunnen worden vervaardigd via batch-emulsificatie8, stroomfocussen 14,15 of stap-emulgering9,11 microfluïdische apparaten, blending 16 of complexe coacervatie17,18. Meestal is er een afweging tussen de fabricagedoorvoer en HMP-monodispersiteit. De mengtechniek levert bijvoorbeeld onregelmatig gevormde en sterk gepolydisperseerde HMP’s op. Batchemulgering of complexe coacervatie maakt de productie van grote volumes polydispersed bolvormige HMP’s mogelijk. Stroomgerichte microfluïdische apparaten zijn gebruikt om sterk monodisperse druppels te fabriceren met een variatiecoëfficiënt van <5%, maar de doorvoer is aanzienlijk laag. In microfluïdische apparaten met stap-emulsificatie maken de sterk geparallelliseerde stappen de high-throughput fabricage van monodispersed HMP'smogelijk 19.
Methacryloyl-gemodificeerde gelatine (GelMA) HMP-bouwstenen zijn thermoresponsief en (foto)chemisch verknoopbaar, waardoor gemakkelijke GHS-fabricage mogelijk is20. Bij afkoeling onder de temperatuur van de bovenste kritische oplossing (UCST)21 (bv. bij 4 °C) worden druppels die een GelMA-oplossing bevatten, omgezet in fysiek verknoopte HMP’s. Deze HMP-bouwstenen worden vervolgens verpakt met behulp van externe krachten (bijvoorbeeld via centrifugatie) om vastgelopen microgel-suspensies te verkrijgen. Tussendeeltjeskoppelingen worden via (foto)chemische crosslinking tussen aangrenzende HMP’s tot stand gebracht om mechanisch robuust GHS14 te vormen. Een van de belangrijkste eigenschappen van GHS is microporositeit, waardoor gemakkelijke celpenetratie in vitro11 en verbeterde weefselingroei in vivo22 mogelijk is. Driedimensionaal (3D) bioprinten van HMP’s wordt conventioneel uitgevoerd met behulp van dicht opeengepakte microgel-suspensies, waardoor de microporositeit23 in het gedrang komt.
We hebben onlangs een nieuwe klasse van granulaire bioinks ontwikkeld op basis van de interfaciale nano-engineering van GelMA-microgels via de adsorptie van heterogeen geladen nanodeeltjes, gevolgd door nanodeeltjes reversibele zelfassemblage. Deze strategie maakt los verpakte microgels afschuif- en extrusie-3D-bioprintbaar, waardoor de porositeit op microschaal van additief vervaardigd GHS11 behouden blijft. Dit artikel presenteert de methoden voor high-throughput GelMA-druppelfabricage, het omzetten van deze druppels in fysiek gekruiste HMP’s, het fabriceren van GelMA HMP’s met behulp van reusbaar poeder, GelMA GHS-formatie, GelMA nanoengineered granular bioink (NGB) -voorbereiding en 3D-bioprinting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gelatine en zijn derivaten zijn de meest gebruikte biomaterialen op basis van eiwitten voor HMP-fabricage. De uitdaging van doorvoer versus deeltjesgrootte monodispersiteit trade-off kan worden overwonnen met behulp van stap-emulsificatie microfluïdische apparaten. Deze apparaten zijn in staat om meer dan 40 miljoen druppels per uur te vormen, met een variatiecoëfficiënt van minder dan 5%27. In dit artikel bespraken we de microfabricage van druppels die GelMA-oplossingen bevatten, gevolgd door …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen T. Pond, onderzoeksondersteuningsspecialist bij de afdeling Chemical Engineering van de Pennsylvania State University (Penn State), de medewerkers van het Nanofabrication Lab van Penn State en Dr. J. de Rutte van Partillion Bioscience bedanken voor de hulp en discussie over nanofabricageprocessen. A. Sheikhi erkent de steun van het Materials Research Institute (MRI) en het College of Engineering Materials Matter at the Human Level seed grants, het Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) en het Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program en het startup-fonds van Penn State. Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) van de National Institutes of Health (NIH) onder toekenningsnummer R56EB032672.
Materials
| 1H,1H-perfluoro-1-octanol | Alfa Aesar, MA, USA | B20156-18 | 98% purity |
| Biopsy punch | Integra Miltex, NY, USA | 33-31A-P/25 | 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System |
| Blunt needle | SANANTS | 30-002-25 | 25 G |
| Bruker Avance NEO 400 MHz | 400 MHz Bruker NEO, MA, USA | NMR device | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5415 C | |
| Centrifuge tube | Celltreat, MA ,USA | 229423 | |
| Coffee filters | BUNN, IL, USA | 20104.0006 | BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct |
| Desiccator | Thermo Scientific | 5311-0250 | Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD |
| Deuterium oxide | Sigma, MA, USA | 151882 | |
| Dialysis membrane (12-14 kDa) | Spectrum Laboratories, NJ, USA | 08-667E | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) | Sigma, MA, USA | 56064C-10L | dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture |
| Erlenmeyer flask | Corning, NY, USA | 4980 | Corning PYREX |
| Ethanol | VWR, PA, USA | 89125-188 | Koptec 200 proof |
| External thread cryogenic vials (cryovials) | Corning, NY, USA | 430659 | |
| Freeze dryer | Labconco, MO, USA | 71042000 | Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000) |
| Gelatin powder | Sigma, MA, USA | G1890-5100G | Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom |
| Glass microscope slides | VWR, PA, USA | 82027-788 | |
| Hotplate | FOUR E'S SCIENTIFIC | MI0102003 | 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F |
| Kimwipes | Fischer scientific, MA, USA | 06-666 | |
| KMPR 1000 negative photoresist series | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | 121619 | KMPR1025 and KMP1035 are included |
| LAPONITE XLG | BYK USA Inc., CT, USA | 2344265 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma, MA, USA | 900889-1G | >95% |
| Luer-Lok connector | BD, NJ, USA | BD 302995 | |
| MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner | SÜSS MicroTeck, German | Nanofabrication device | |
| Methacylate anhydride | Sigma, MA, USA | 276685-100ML | contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94% |
| Milli-Q water | Millipore Corporation, MA, USA | ZRQSVR5WW | electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System |
| Novec 7500 engineering fluid | 3M, MN, USA | 3M ID 7100003723 | |
| Oven | VWR, PA, USA | VWR-1410 | 1410 Vacuum Oven |
| Parafilm | Fischer scientific, MA, USA | HS234526C | |
| Pasteur pipette | VWR, PA, USA | 14673-010 | |
| Petri dish | VWR, PA, USA | 25384-092 | polystyrene |
| Pico-Surf | Sphere Fluidics, UK | C022 | (5% (w/w) in Novec 7500) |
| Pipette | VWR, PA, USA | 89079-970 | |
| Pipette tips | VWR, PA, USA | 87006-060 | |
| Plasma cleaner chamber | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-001-HP | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning, MI, USA | 2065623 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Positive displacement pipette | Microman E M100E, Gilson, OH, USA | M100E | |
| Silicon wafers | UniversityWafer, MA, USA | 452/1196 | 4-inch mechanical grade |
| Spatula | VWR, PA, USA | 231-0104 | Disposable |
| SU-8 | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA, USA | 70-2001 | PHD 2000 |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Millipore Sigma, MA, USA | 448931-10G | 97% |
| Tygon tubings | Saint-globain, PA, USA | AAD04103 | |
| UV light | QUANS | Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W | |
| Vacuum filtration unit | VWR, PA, USA | 10040-460 | 0.20 µm |
| Vortex | Fischer scientific, USA | 14-955-151 | Mini Vortex Mixer |
Riferimenti
- Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 18 (36), 2201115 (2022).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication. Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).
- Zoratto, N., et al. In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering. Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).
- Yuan, Z., et al. In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care. Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).
- Ataie, Z., et al. Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting. Small. 18 (37), 2202390 (2022).
- Annabi, N., et al. 25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
- Rajabi, N., et al. Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair. Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).
- Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity. U.S. Patent Application. , (2021).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization. MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).
- Van Den Bulcke, A. I., et al. Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels. Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3d printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Claaßen, C., et al. Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls. Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).
- Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids. U.S. Patent Application. , (2022).
- Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
- Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules. ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).
- Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. Mechanical reinforcement of granular hydrogels. Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).
