Intra-peritoneale transplantatie voor het genereren van acute myeloïde leukemie bij muizen
Summary
Hier wordt intra-peritoneale injectie van leukemiecellen gebruikt om acute myeloïde leukemie (AML) bij muizen vast te stellen en te verspreiden. Deze nieuwe methode is effectief bij de seriële transplantatie van AML-cellen en kan dienen als een alternatief voor diegenen die problemen en inconsistenties kunnen ervaren met intraveneuze injectie bij muizen.
Abstract
Er is een onvervulde behoefte aan nieuwe therapieën voor de behandeling van acute myeloïde leukemie (AML) en de bijbehorende terugval waarbij persistente leukemiestamcellen (LSC’s) betrokken zijn. Een experimenteel AML-knaagdiermodel om therapieën te testen op basis van het succesvol transplanteren van deze cellen via retro-orbitale injecties in ontvangende muizen is beladen met uitdagingen. Het doel van deze studie was om een eenvoudige, betrouwbare en consistente methode te ontwikkelen om een robuust muizenmodel van AML te genereren met behulp van een intra-peritoneale route. In het huidige protocol werden beenmergcellen getransduceerd met een retrovirus dat humaan MLL-AF9-fusie-oncoproteïne tot expressie brengt. De efficiëntie van afstammingsnegatieve (Lin-) en Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populaties als donor-LSC’s bij de ontwikkeling van primaire AML werd getest en intra-peritoneale injectie werd aangenomen als een nieuwe methode om AML te genereren. Vergelijking tussen intra-peritoneale en retro-orbitale injecties werd gedaan in seriële transplantaties om de twee methoden te vergelijken en te contrasteren. Zowel Lin– als LSK-cellen getransduceerd met humaan MLL-AF9-virus goed geënt in het beenmerg en de milt van ontvangers, wat leidt tot een volledige AML. De intra-peritoneale injectie van donorcellen vestigde AML in ontvangers bij seriële transplantatie en de infiltratie van AML-cellen werd gedetecteerd in het bloed, beenmerg, milt en lever van ontvangers door flowcytometrie, qPCR en histologische analyses. Intra-peritoneale injectie is dus een efficiënte methode van AML-inductie met behulp van seriële transplantatie van donorleukemische cellen.
Introduction
Acute myeloïde leukemie (AML) is een vorm van hematologische maligniteit van diverse etiologie met een slechte prognose1. De generatie van AML-diermodellen legt de basis voor het begrijpen van de complexe variaties en pathobiologie in een poging om nieuwe therapieën te ontdekken2. Leukemogenese bij muizen omvat de transplantatie van donorcellen die fusie-oncoproteïnen tot expressie brengen, inclusief fusies waarbij het gen voor gemengde afstammingsleukemie (MLL) betrokken is om AML krachtig te induceren, om de ziekte bij mensen na te bootsen3. Verschillende cellulaire oorsprong van donorcellen zijn gemeld bij de transplantatie van MLL-gen-geassocieerde AML4, waarbij zeer weinig bekend is over de cellen die verantwoordelijk zijn voor de oorsprong van de ziekte.
Er zijn meerdere routes ontwikkeld voor transplantatie bij muizen; in plaats van een intrafemorale injectie, die direct gemuteerde donorcellen in beenmerg5 introduceert, is een intraveneuze injectie die gebruik maakt van de veneuze sinusplexus, staartader en halsader op grote schaal gebruikt om murine AML-modellen 6,7,8,9 te genereren. In het geval van retro-orbitale (r.o.) injectie zijn verschillende inherente nadelen, zoals volumebeperking, hoge technische vraag, weinig kans op herhaalde pogingen of fouten, en potentieel oogletsel, grote struikelblokken geweest met beperkte of geen haalbare alternatieven7. Staartaderinjectie kan vergelijkbare problemen hebben naast lokale verwondingen; Om de procedure te vergemakkelijken, moeten muizen vaak worden opgewarmd om hun staartaders te verwijden10. Het is ook moeilijk om de staartader te lokaliseren zonder een extra lichtbron, vooral in de C57BL / 6-muizenstam. Voor jugulaire aderinjectie heeft onderzoekspersoneel voldoende training nodig om de ader te lokaliseren en mogelijke complicaties te beperken. Bovendien moeten zowel veneuze sinus- als halsaderinjecties onder anesthesie worden uitgevoerd, wat een ander niveau van complexiteit toevoegt. Het is dus verleidelijk om nieuwe routes voor transplantatie te verkennen om de oprichting van AML-muizenmodellen te vergemakkelijken.
Intra-peritoneale (i.p.) injectie wordt vaak gebruikt voor het toedienen van geneesmiddelen, kleurstoffen en anesthetica 11,12,13,14,15; Het is ook gebruikt om hematopoëtische cellen te introduceren voor ectopische hematopoëse16 en om van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen te transplanteren in verschillende muismodellen 17,18,19,20,21. Het is echter niet vaak gebruikt om hematopoëtische maligniteiten bij muizen vast te stellen, met name om de progressie van de AML-ziekte te bestuderen.
De huidige studie beschrijft de haalbaarheid van i.p. injectie bij het genereren van AML-muismodellen, naast het vergelijken van de transplantatie-efficiëntie van afstammingsnegatieve (Lin-) en Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populaties als donorcellen. Deze bevindingen bieden een eenvoudige en efficiënte manier om experimentele modellen van AML en gerelateerde myeloïde leukemieën te genereren. Een dergelijke methode heeft het potentieel om ons begrip van de ziektemechanismen te vergroten en een relatief eenvoudig model te bieden om experimentele therapieën te testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze hierboven beschreven studies leveren ondersteunend bewijs dat de transplantatie van Lin-cellen vergelijkbaar is met LSK-cellen bij de generatie van 1° murine AML. Bovendien laten de huidige gegevens ook zien dat ip-injectie een efficiënte en handige methode is om murine AML vast te stellen in vergelijking met intraveneuze (of r.o.) injectie.
Naast LSK-cellen is gemeld dat andere populaties zoals granulocyt-monocytenvoorloper (GMP), gewone lymfoïde voorloper (CLP) en gewone m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de Flow Cytometry Core Facility van het Huck Institute en de Histopathology Core Facility van het Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, voor het bieden van tijdige technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, toetredingsnummer 00000005 K.S.P. en R.F.P.
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
Riferimenti
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. . The Laboratory Mouse. , (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
