Intraperitoneale Transplantation zur Erzeugung akuter myeloischer Leukämie bei Mäusen
Summary
Dabei wird die intraperitoneale Injektion von Leukämiezellen genutzt, um eine akute myeloische Leukämie (AML) bei Mäusen zu etablieren und zu propagieren. Diese neue Methode ist bei der seriellen Transplantation von AML-Zellen wirksam und kann als Alternative für diejenigen dienen, bei denen Schwierigkeiten und Inkonsistenzen bei der intravenösen Injektion bei Mäusen auftreten können.
Abstract
Es besteht ein ungedeckter Bedarf an neuartigen Therapien zur Behandlung der akuten myeloischen Leukämie (AML) und des damit verbundenen Rezidivs, an dem persistierende Leukämiestammzellen (LSCs) beteiligt sind. Ein experimentelles AML-Nagetiermodell zur Erprobung von Therapien, die auf der erfolgreichen Transplantation dieser Zellen durch retroorbitale Injektionen in Empfängermäusen basieren, ist mit Herausforderungen verbunden. Das Ziel dieser Studie war es, eine einfache, zuverlässige und konsistente Methode zu entwickeln, um ein robustes murines AML-Modell auf intraperitonealer Route zu generieren. Im vorliegenden Protokoll wurden Knochenmarkszellen mit einem Retrovirus transduziert, das humanes MLL-AF9-Fusions-Onkoprotein exprimiert. Die Effizienz von liniennegativen (Lin-) und Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) Populationen als Spender-LSCs bei der Entwicklung der primären AML wurde getestet und die intraperitoneale Injektion als neue Methode zur Erzeugung von AML eingeführt. Der Vergleich zwischen intraperitonealen und retroorbitalen Injektionen wurde bei seriellen Transplantationen durchgeführt, um die beiden Methoden zu vergleichen und gegenüberzustellen. Sowohl Lin– als auch LSK-Zellen, die mit dem humanen MLL-AF9-Virus transduzierten, transplantierten gut in das Knochenmark und die Milz der Empfänger, was zu einer ausgewachsenen AML führte. Die intraperitoneale Injektion von Spenderzellen etablierte AML bei Empfängern nach serieller Transplantation, und die Infiltration von AML-Zellen wurde im Blut, Knochenmark, Milz und Leber der Empfänger durch Durchflusszytometrie, qPCR und histologische Analysen nachgewiesen. Daher ist die intraperitoneale Injektion eine effiziente Methode der AML-Induktion durch serielle Transplantation von Spenderleukämiezellen.
Introduction
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine Form der hämatologischen Malignität unterschiedlicher Ätiologie mit schlechter Prognose1. Die Generierung von AML-Tiermodellen legt den Grundstein für das Verständnis ihrer komplexen Variationen und Pathobiologie, um neue Therapien zu entdecken2. Die Leukämiegenese bei Mäusen umfasst die Transplantation von Spenderzellen, die Fusions-Onkoproteine exprimieren, einschließlich Fusionen, an denen das MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) beteiligt ist, um AML stark zu induzieren und die Krankheit beim Menschen nachzuahmen3. Bei der Transplantation von MLL-Gen-assoziierter AML4 wurden verschiedene zelluläre Ursprünge von Spenderzellen beschrieben, wobei nur sehr wenig über die Zellen bekannt ist, die für die Entstehung der Krankheit verantwortlich sind.
Es wurden mehrere Wege für die Transplantation in Mäuse entwickelt. Anstelle einer intrafemoralen Injektion, bei der mutierte Spenderzellen direkt in das Knochenmark eingeführt werden5, wurde eine intravenöse Injektion, bei der der venöse Sinusplexus, die Schwanzvene und die Halsvene verwendet werden, häufig verwendet, um murine AML-Modelle zu erzeugen 6,7,8,9. Im Falle der retroorbitalen Injektion waren verschiedene inhärente Nachteile, wie z. B. Volumenbegrenzung, hohe technische Anforderungen, geringe Wahrscheinlichkeit von Wiederholungsversuchen oder Fehlern und mögliche Augenverletzungen, große Stolpersteine mit begrenzten oder gar keinen praktikablen Alternativen7. Die Injektion einer Schwanzvene kann neben lokalen Verletzungen ähnliche Probleme haben. Um den Eingriff zu erleichtern, müssen Mäuse oft aufgewärmt werden, um ihre Schwanzvenen zu erweitern10. Es ist auch schwierig, die Schwanzvene ohne eine zusätzliche Lichtquelle zu lokalisieren, insbesondere beim Mäusestamm C57BL/6. Für die Injektion einer Halsvene benötigt das Forschungspersonal eine ausreichende Ausbildung, um die Vene zu lokalisieren und mögliche Komplikationen zu begrenzen. Darüber hinaus müssen sowohl Venenhöhlen- als auch Jugularveneninjektionen unter Narkose durchgeführt werden, was die Komplexität noch erhöht. Daher ist es verlockend, neue Wege für die Transplantation zu erkunden, um die Etablierung von AML-Mausmodellen zu erleichtern.
Die intraperitoneale (i.p.) Injektion wird häufig zur Verabreichung von Medikamenten, Farbstoffen und Anästhetika verwendet 11,12,13,14,15; Es wurde auch verwendet, um hämatopoetische Zellen für die ektopische Hämatopoeseeinzuführen 16 und aus dem Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen in verschiedene Mausmodelle zu transplantieren 17,18,19,20,21. Es wurde jedoch nur selten zur Feststellung hämatopoetischer Malignome bei Mäusen eingesetzt, insbesondere zur Untersuchung des Fortschreitens der AML-Erkrankung.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Machbarkeit der i.p. Injektion bei der Generierung von AML-Mausmodellen und vergleicht die Transplantationseffizienz von liniennegativen (Lin-) und Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) Populationen als Spenderzellen. Diese Ergebnisse bieten eine einfache und effiziente Möglichkeit, experimentelle Modelle für AML und verwandte myeloische Leukämien zu erstellen. Eine solche Methode hat das Potenzial, unser Verständnis der Krankheitsmechanismen zu verbessern und ein relativ einfaches Modell für die Erprobung experimenteller Therapien zu liefern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese oben beschriebenen Studien liefern unterstützende Hinweise darauf, dass die Transplantation von Lin– Zellen bei der Erzeugung von 1° muriner AML mit LSK-Zellen vergleichbar ist. Darüber hinaus zeigen die aktuellen Daten auch, dass die i.p. Injektion im Vergleich zur intravenösen (oder r.o.) Injektion eine effiziente und bequeme Methode zur Etablierung einer murinen AML ist.
Zusätzlich zu LSK-Zellen wurde berichtet, dass andere Populationen wie der Granulozyten-Monozyten-V…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Core Facility für Durchflusszytometrie des Huck-Instituts und der Core Facility für Histopathologie des Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, für die rechtzeitige technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des American Institute for Cancer Research (KSP), des Penn State College of Agricultural Sciences, des Penn State Cancer Institute, des USDA-NIFA-Projekts 4771, der Beitrittsnummer 00000005 zu K.S.P. und R.F.P. unterstützt.
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
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