Intraperitoneal transplantasjon for generering av akutt myelogen leukemi hos mus
Summary
Her brukes intraperitoneal injeksjon av leukemiceller for å etablere og forplante akutt myelogen leukemi (AML) hos mus. Denne nye metoden er effektiv i seriell transplantasjon av AML-celler og kan tjene som et alternativ for de som kan oppleve vanskeligheter og inkonsekvenser med intravenøs injeksjon hos mus.
Abstract
Det er et udekket behov for nye terapier for å behandle akutt myelogen leukemi (AML) og tilhørende tilbakefall som involverer vedvarende leukemi stamceller (LSCs). En eksperimentell AML-gnagermodell for å teste terapier basert på vellykket transplantasjon av disse cellene via retro-orbitale injeksjoner hos mottakermus er full av utfordringer. Målet med denne studien var å utvikle en enkel, pålitelig og konsistent metode for å generere en robust murine modell av AML ved hjelp av en intraperitoneal rute. I denne protokollen ble benmargsceller transdusert med et retrovirus som uttrykker humant MLL-AF9-fusjonsonkoprotein. Effektiviteten av populasjoner av lineage negative (Lin-) og Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) som donor-LSC i utviklingen av primær AML ble testet, og intraperitoneal injeksjon ble tatt i bruk som en ny metode for å generere AML. Sammenligning mellom intraperitoneale og retroorbitale injeksjoner ble gjort i serietransplantasjoner for å sammenligne og kontrastere de to metodene. Både Lin– og LSK-celler transducert med humant MLL-AF9-virus innpodet godt i benmarg og milt hos mottakere, noe som førte til en fullblåst AML. Intraperitoneal injeksjon av donorceller etablerte AML hos mottakere ved serietransplantasjon, og infiltrasjon av AML-celler ble påvist i blod, benmarg, milt og lever hos mottakere ved flowcytometri, qPCR og histologiske analyser. Dermed er intraperitoneal injeksjon en effektiv metode for AML-induksjon ved bruk av seriell transplantasjon av donor leukemiske celler.
Introduction
Akutt myelogen leukemi (AML) er en type hematologisk malignitet av ulik etiologi med dårlig prognose1. Genereringen av AML-dyremodeller legger grunnlaget for forståelsen av dens komplekse variasjoner og patobiologi i et forsøk på å oppdage nye terapier2. Leukemogenese hos mus involverer transplantasjon av donorceller som uttrykker fusjonsonkoproteiner, inkludert fusjoner som involverer genet blandet avstamningsleukemi (MLL) for å indusere AML, for å etterligne sykdommen hos mennesker3. Ulike cellulære opprinnelser av donorceller har blitt rapportert ved transplantasjon av MLL-genassosiert AML4, med svært lite kjent om cellene som er ansvarlige for sykdommens opprinnelse.
Flere ruter er utviklet for transplantasjon hos mus; I stedet for en intrafemoral injeksjon, som direkte introduserer mutante donorceller i benmarg5, har en intravenøs injeksjon som benytter venøs sinus plexus, hale vene og jugularvenen blitt mye brukt til å generere murine AML-modeller 6,7,8,9. Når det gjelder retro-orbital (r.o.) injeksjon, har ulike iboende ulemper, som volumbegrensning, høy teknisk etterspørsel, få sjanser for gjentatte forsøk eller feil, og potensielle okulære skader, vært store snublesteiner med begrensede eller ingen levedyktige alternativer7. Tail vein injeksjon kan ha lignende problemer i tillegg til lokale skader; For å lette prosedyren, må mus ofte varmes opp for å utvide haleårene10. Det er også vanskelig å lokalisere halevenen uten en ekstra lyskilde, spesielt i C57BL/6-stammen til mus. For jugularveneinjeksjon krever forskningspersonell tilstrekkelig trening for å lokalisere venen og begrense mulige komplikasjoner. I tillegg må både venøs sinus og jugularveninjeksjoner utføres under anestesi, noe som legger til et annet nivå av kompleksitet. Det er derfor fristende å utforske nye transplantasjonsveier for å lette etableringen av AML-murinmodeller.
Intraperitoneal (i.p.) injeksjon brukes ofte til å administrere medisiner, fargestoffer og anestetika 11,12,13,14,15; Det har også blitt brukt til å introdusere hematopoietiske celler for ektopisk hematopoiesis16 og å transplantere benmargsavledede mesenkymale stamceller i forskjellige musemodeller 17,18,19,20,21. Det har imidlertid blitt sjelden brukt til å etablere hematopoietiske maligniteter hos mus, spesielt for å studere AML sykdomsprogresjon.
Denne studien beskriver gjennomførbarheten av i.p. injeksjon i genereringen av AML-musemodeller, i tillegg til å sammenligne transplantasjonseffektiviteten av avstamningsnegative (Lin-) og Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) populasjoner som donorceller. Disse funnene gir en enkel og effektiv måte å generere eksperimentelle modeller av AML og relaterte myelogen leukemier. En slik metode har potensial til å fremme vår forståelse av sykdomsmekanismene, samt gi en relativt enkel modell for å teste eksperimentelle terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Disse ovenfor beskrevne studiene gir støttende bevis på at transplantasjon av Lin-celler er sammenlignbar med LSK-celler i genereringen av 1° murine AML. I tillegg viser de nåværende dataene også at i.p. injeksjon er en effektiv og praktisk metode for å etablere murine AML sammenlignet med intravenøs (eller r.o.) injeksjon.
I tillegg til LSK-celler har andre populasjoner som granulocytt-monocytt-stamfar (GMP), vanlig lymfoid stamfar (CLP) og vanlig myeloid stamfar (CMP) blit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Huck Institute’s Flow Cytometry Core Facility og Histopathology Core Facility of the Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, for å gi rettidig teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA prosjekt 4771, tiltredelsesnummer 00000005 til KSP og RFP
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
Riferimenti
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. . The Laboratory Mouse. , (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
