Transplante Intra-Peritoneal na Geração de Leucemia Mielóide Aguda em Camundongos
Summary
Aqui, a injeção intraperitoneal de células leucêmicas é utilizada para estabelecer e propagar a leucemia mieloide aguda (LMA) em camundongos. Este novo método é eficaz no transplante seriado de células da LMA e pode servir como uma alternativa para aqueles que podem experimentar dificuldades e inconsistências com a injeção intravenosa em camundongos.
Abstract
Há uma necessidade não atendida de novas terapias para tratar a leucemia mieloide aguda (LMA) e a recaída associada que envolve células-tronco de leucemia persistente (LSCs). Um modelo experimental de roedores com LMA para testar terapias baseadas no transplante bem-sucedido dessas células via injeções retroorbitais em camundongos receptores é repleto de desafios. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método fácil, confiável e consistente para gerar um modelo murino robusto de LMA usando uma via intraperitoneal. No presente protocolo, células da medula óssea foram transduzidas com um retrovírus expressando oncoproteína de fusão MLL-AF9 humana. A eficiência de populações de linhagem negativa (Lin-) e Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) como LSCs doadoras no desenvolvimento de LMA primária foi testada, e a injeção intraperitoneal foi adotada como um novo método para gerar LMA. A comparação entre as injeções intraperitoneais e retro-orbitárias foi feita em transplantes seriados para comparar e contrastar os dois métodos. As células de Lin e LSK transduzidas com o vírus MLL-AF9 humano enxertado bem na medula óssea e no baço dos receptores, levando a uma LMA completa. A injeção intraperitoneal de células doadoras estabeleceu LMA em receptores após transplante seriado, e a infiltração de células de LMA foi detectada no sangue, medula óssea, baço e fígado dos receptores por citometria de fluxo, qPCR e análises histológicas. Assim, a injeção intraperitoneal é um método eficiente de indução de LMA utilizando transplante seriado de células leucêmicas de doadores.
Introduction
A leucemia mieloide aguda (LMA) é um tipo de neoplasia hematológica de etiologia diversa e de mau prognóstico1. A geração de modelos animais de LMA estabelece as bases para a compreensão de suas complexas variações e patobiologia em um esforço para descobrir novas terapias2. A leucemogênese em camundongos envolve o transplante de células doadoras expressando oncoproteínas de fusão, incluindo fusões envolvendo o gene da leucemia de linhagem mista (MLL) para induzir potentemente a LMA, para mimetizar a doença em humanos3. Várias origens celulares de células de doadores têm sido relatadas no transplante de LMA4 associada ao gene MLL, sendo pouco conhecido sobre as células responsáveis pela origem da doença.
Múltiplas vias têm sido desenvolvidas para transplante em camundongos; em vez de uma injeção intrafemoral, que introduz diretamente células doadoras mutantes na medulaóssea5, uma injeção intravenosa que utiliza o plexo sinusal venoso, a veia caudal e a veia jugular tem sido amplamente utilizada para gerar modelos murinos de LMA 6,7,8,9. No caso da injeção retro-orbitária (r.o.), várias desvantagens inerentes, como limitação de volume, alta demanda técnica, poucas chances de tentativas repetidas ou erro e possíveis lesões oculares, têm sido grandes obstáculos com alternativas limitadas ou inviáveis7. A injeção da veia caudal pode ter problemas semelhantes, além de lesões locais; Para facilitar o procedimento, os camundongos muitas vezes precisam ser aquecidos para dilatar as veias da cauda10. Também é difícil localizar a veia da cauda sem uma fonte de luz adicional, particularmente na linhagem C57BL/6 de camundongos. Para a injeção da veia jugular, o pessoal da pesquisa requer treinamento suficiente para localizar a veia e limitar possíveis complicações. Além disso, tanto as injeções do seio venoso quanto da veia jugular precisam ser realizadas sob anestesia, o que acrescenta outro nível de complexidade. Assim, é tentador explorar novas rotas de transplante para facilitar o estabelecimento de modelos murinos de LMA.
A injeção intraperitoneal (i.p.) é comumente utilizada para administração de fármacos, corantes e anestésicos 11,12,13,14,15; Também tem sido utilizada na introdução de células hematopoéticas para hematopoese ectópica16 e no transplante de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea em vários modelos murinos 17,18,19,20,21. No entanto, tem sido pouco utilizada para estabelecer neoplasias hematopoéticas em camundongos, particularmente para estudar a progressão da doença da LMA.
O presente estudo descreve a viabilidade da injeção i.p. na geração de modelos de LMA em camundongos, além de comparar a eficiência do transplante de populações de linhagem negativa (Lin-) e Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) como células doadoras. Esses achados fornecem uma maneira simples e eficiente de gerar modelos experimentais de LMA e leucemias mieloides relacionadas. Tal método tem o potencial de aprofundar nossa compreensão dos mecanismos da doença, bem como fornecer um modelo relativamente fácil para testar terapias experimentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esses estudos descritos acima fornecem evidências de suporte de que o transplante de células Lin– é comparável às células LSK na geração de 1° de LMA murina. Além disso, os dados atuais também mostram que a injeção i.p. é um método eficiente e conveniente para estabelecer LMA murina em comparação com a injeção intravenosa (ou r.o.).
Além das células LSK, outras populações, como o progenitor de granulócitos monócitos (GMP), o progenitor linfoide comum (CLP) e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Flow Cytometry Core Facility do Instituto Huck e ao Histopathology Core Facility do Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, por fornecer suporte técnico oportuno. Este trabalho foi apoiado por subsídios do American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, número de adesão 00000005 ao K.S.P. e R.F.P.
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
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