Surveillance bioluminescente de la survie du greffon dans un modèle de transfert adoptif du diabète auto-immun chez la souris
Summary
Ce protocole décrit une méthode simple et peu invasive pour la transplantation et l’imagerie de cellules NIT-1 chez des souris immunodéficientes combinées diabétiques sévères non obèses (NOD) défiées avec des splénocytes purifiés à partir de souris NOD spontanément diabétiques.
Abstract
Le diabète de type 1 est caractérisé par la destruction auto-immune des cellules bêta productrices d’insuline du pancréas. Un traitement prometteur pour cette maladie est la transplantation de cellules bêta dérivées de cellules souches. Des modifications génétiques, cependant, peuvent être nécessaires pour protéger les cellules transplantées de l’auto-immunité persistante. Les modèles murins diabétiques sont un outil utile pour l’évaluation préliminaire des stratégies visant à protéger les cellules transplantées contre les attaques auto-immunes. Décrit ici est une méthode mini-invasive pour la transplantation et l’imagerie des greffes cellulaires dans un modèle de transfert adoptif du diabète chez la souris. Dans ce protocole, les cellules de la lignée cellulaire bêta pancréatique murine NIT-1 exprimant le transgène luciférase luciférase luc2 sont transplantées par voie sous-cutanée chez des souris immunodéficientes non obèses diabétiques (NOD) immunodéficientes combinées sévères (SCID). Ces souris sont injectées simultanément par voie intraveineuse avec des splénocytes de souris NOD spontanément diabétiques pour transférer l’auto-immunité. Les greffons sont imagés à intervalles réguliers via une imagerie bioluminescente non invasive pour surveiller la survie cellulaire. La survie des cellules mutantes est comparée à celle des cellules témoins transplantées dans la même souris.
Introduction
Le diabète de type 1 (DT1) est causé par la destruction auto-immune des cellules bêta productrices d’insuline du pancréas. La perte de masse des cellules bêta entraîne une carence en insuline et une hyperglycémie. Les patients atteints de DT1 dépendent de multiples injections quotidiennes d’insuline exogène et connaissent des épisodes d’hyperglycémie et d’hypoglycémie sévères tout au long de leur vie. Les complications liées à ces épisodes comprennent la rétinopathie diabétique, la diminution de la fonction rénale et la neuropathie1.
Les injections d’insuline sont un traitement, mais pas un remède contre le DT1. Le remplacement de la masse cellulaire bêta perdue, cependant, a le potentiel d’inverser la maladie en permettant aux patients de produire leur propre insuline. Cependant, l’offre d’îlots donneurs cadavériques est limitée2. Les îlots dérivés de cellules souches (îlots SC) peuvent fournir un approvisionnement pratiquement illimité de cellules bêta pour la transplantation. Plusieurs groupes ont démontré que les cellules souches embryonnaires humaines (CSE) et les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) peuvent être différenciées pour générer des cellules fonctionnelles de type bêta 3,4,5. Des données prometteuses d’essais cliniques préliminaires indiquent que ces cellules conservent leur fonction après la greffe et peuvent permettre aux patients de devenir insulino-indépendants6. Une immunosuppression chronique est toutefois nécessaire, augmentant ainsi leur susceptibilité au cancer et à l’infection. De plus, les agents immunosuppresseurs peuvent être cytotoxiques pour les greffons à long terme7. Pour éliminer le besoin d’immunosuppression, les îlots SC peuvent être génétiquement modifiés pour les protéger de l’auto-immunité récurrente ainsi que de l’allo-immunité après la transplantation.
La recherche sur les cellules souches est très exigeante en termes de coûts et de main-d’œuvre. Les lignées cellulaires de souris et les modèles animaux sont des outils utiles pour l’identification initiale et la validation expérimentale de stratégies visant à protéger les cellules transplantées contre l’auto-immunité. La souris NOD développe un diabète auto-immun spontané avec de nombreuses similitudes avec le DT18 humain, et la lignée cellulaire d’insulinome NIT-1 partage un fond génétique avec cette souchede souris 9. Le diabète peut être transféré de manière adoptive à la souche de souris NOD-scid immunodéficiente apparentée par injection de splénocytes diabétiques de souris NOD afin de synchroniser temporellement l’apparition du diabète chez des souris expérimentales répliquées10. Ce modèle peut être utilisé pour identifier des cibles génétiques relativement rapidement et à peu de frais pour une validation ultérieure dans les îlots SC. Récemment, la méthode a été appliquée pour identifier et valider RNLS, une cible qui a été trouvée pour protéger les îlots humains primaires de l’auto-immunité in vivo et les îlots dérivés de l’iPSC du stress des cellules bêta in vitro11. Décrit ici est un protocole simple pour transplanter des cellules NIT-1 génétiquement modifiées et surveiller de manière non invasive leur survie dans un modèle de transfert adoptif du diabète auto-immun chez la souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le DT1 est une maladie dévastatrice pour laquelle il n’existe actuellement aucun remède. La thérapie de remplacement des cellules bêta offre un traitement prometteur pour les patients atteints de cette maladie, mais l’obstacle critique à cette stratégie est le potentiel d’attaque auto-immune récurrente contre les cellules bêta transplantées. Le génie génétique des cellules SC-bêta pour réduire leur visibilité immunitaire ou leur susceptibilité est une solution potentielle à ce problème. Décrit ic…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Erica P. Cai et le Dr Yuki Ishikawa d’avoir développé la méthode décrite dans ce protocole (voir réf. 11). La recherche dans les laboratoires de S.K. et de P.Y. est financée par des subventions des National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), de FRDJ, du Harvard Stem Cell Institute et de la Fondation Beatson. T.S. a été soutenu par une bourse postdoctorale de l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) (T32 DK007260-45), et K.B. a été soutenu en partie par une bourse de la Fondation Mary K. Iacocca.
Materials
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
Riferimenti
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