ניטור ביולומינסנטי של הישרדות השתל במודל העברה מאומץ של סוכרת אוטואימונית בעכברים
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וזעיר פולשנית להשתלה והדמיה של תאי NIT-1 בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים (NOD) – עכברים משולבים בעלי כשל חיסוני חמור המאותגרים בטחול מטוהר מעכברי NOD סוכרתיים ספונטניים.
Abstract
סוכרת מסוג 1 מאופיינת בהרס אוטואימוני של תאי בטא מייצרי אינסולין בלבלב. טיפול מבטיח למחלה זו הוא השתלת תאי בטא שמקורם בתאי גזע. שינויים גנטיים, עם זאת, עשויים להיות נחוצים כדי להגן על התאים המושתלים מפני אוטואימוניות מתמשכת. מודלים של עכברים סוכרתיים הם כלי שימושי להערכה ראשונית של אסטרטגיות להגנה על תאים מושתלים מפני התקפה אוטואימונית. מתוארת כאן שיטה זעיר פולשנית להשתלה והדמיה של שתלי תאים במודל העברה מאומץ של סוכרת בעכברים. בפרוטוקול זה, תאים מקו תאי הבטא של הלבלב NIT-1 המבטאים את הטרנסגן Luc2 של הגחלילית מושתלים תת עורית בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים (NOD) – חמורים בעלי ליקוי חיסוני משולב חיסוני (SCID). עכברים אלה מוזרקים בו זמנית לווריד עם טחול מעכברי NOD סוכרתיים ספונטניים כדי להעביר אוטואימוניות. השתלים מצולמים במרווחי זמן קבועים באמצעות הדמיה ביולומינסנטית לא פולשנית כדי לעקוב אחר הישרדות התא. הישרדותם של תאים מוטנטיים מושווית לזו של תאי ביקורת המושתלים באותו עכבר.
Introduction
סוכרת מסוג 1 (T1D) נגרמת על ידי הרס אוטואימוני של תאי בטא מייצרי אינסולין של הלבלב. אובדן מסת תאי בטא גורם למחסור באינסולין ולהיפרגליקמיה. חולי סוכרת סוג 1 מסתמכים על זריקות יומיות מרובות של אינסולין אקסוגני וחווים אפיזודות של היפרגליקמיה חמורה והיפוגליקמיה לאורך חייהם. הסיבוכים הקשורים לפרקים אלה כוללים רטינופתיה סוכרתית, ירידה בתפקוד הכליות ונוירופתיה1.
זריקות אינסולין הן טיפול אך לא תרופה לסוכרת סוג 1. החלפת מסת תאי הבטא שאבדו, לעומת זאת, יש פוטנציאל להפוך את המחלה על ידי מתן אפשרות לחולים לייצר אינסולין משלהם. עם זאת, היצע האיים התורמים הגווארי מוגבל2. איים שמקורם בתאי גזע (SC-islets) עשויים לספק אספקה כמעט בלתי מוגבלת של תאי בטא להשתלה. מספר קבוצות הוכיחו כי תאי גזע עובריים אנושיים (ESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) יכולים להיות ממוינים כדי ליצור תאים דמויי בטא פונקציונליים 3,4,5. נתונים מבטיחים מניסויים קליניים מוקדמים מצביעים על כך שתאים אלה שומרים על תפקודם לאחר ההשתלה ועשויים לאפשר לחולים להיות בלתי תלויים באינסולין6. עם זאת, נדרש דיכוי חיסוני כרוני, ובכך להגביר את רגישותם לסרטן ולזיהום. בנוסף, סוכני אימונוסופרסיביים עשויים להיות ציטוטוקסיים לשתלים בטווח הארוך7. כדי למנוע את הצורך בדיכוי חיסוני, איי SC עשויים להיות מהונדסים גנטית כדי להגן עליהם מפני אוטואימוניות חוזרת, כמו גם אלוחסינות לאחר ההשתלה.
מחקר תאי גזע הוא תובעני מאוד בעלויות ובעבודה. קווי תאים של עכברים ומודלים של בעלי חיים הם כלים שימושיים לזיהוי ראשוני ותיקוף ניסיוני של אסטרטגיות להגנה על תאים מושתלים מפני אוטואימוניות. עכבר NOD מפתח סוכרת אוטואימונית ספונטנית עם קווי דמיון רבים לסוכרת סוג1 8 אנושית, וקו תאי האינסולינומה NIT-1 חולק רקע גנטי עם זן עכברזה 9. סוכרת יכולה להיות מועברת באופן מאומץ לזן עכבר NOD-scid הקשור למערכת החיסון באמצעות הזרקה של טחול סוכרתי מעכברי NOD על מנת לסנכרן באופן זמני את הופעת הסוכרת בעכברי ניסוימשוכפלים 10. מודל זה יכול לשמש לזיהוי מטרות גנטיות במהירות ובזול יחסית לצורך אימות נוסף באיי SC. לאחרונה, השיטה יושמה כדי לזהות ולאמת RNLS, מטרה שנמצאה כמגנה על איים אנושיים ראשוניים מפני אוטואימוניות in vivo ואיים שמקורם ב- iPSC מלחץ תאי בטא במבחנה11. מתואר כאן פרוטוקול פשוט להשתלת תאי NIT-1 מהונדסים גנטית ולמעקב לא פולשני אחר הישרדותם במודל העברה מאומץ של סוכרת אוטואימונית בעכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
סוכרת סוג 1 היא מחלה הרסנית שאין לה כיום תרופה. טיפול בתחליפי תאי בטא מציע טיפול מבטיח לחולים במחלה זו, אך המחסום הקריטי לאסטרטגיה זו הוא הפוטנציאל להתקפה אוטואימונית חוזרת ונשנית נגד תאי הבטא המושתלים. ההנדסה הגנטית של תאי SC-beta כדי להפחית את הנראות או הרגישות החיסונית שלהם היא פתרון אפשרי …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר אריקה פ. קאי ולד”ר יוקי אישיקאווה על פיתוח השיטה המתוארת בפרוטוקול זה (ראה הערה 11). המחקר במעבדות של ס.ק. ופ.י. נתמך על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, מכון תאי הגזע של הרווארד וקרן ביטסון. ט.ס. נתמכה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK) (T32 DK007260-45), וק.ב. נתמכה בחלקה על ידי מלגה מקרן מרי ק. איאקוקה.
Materials
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
Riferimenti
- Katsarou, A., et al. Type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016 (2017).
- Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire Available from: https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes (2021)
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic β-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors. Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).
- Cai, E. P., et al. Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes. Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).
- Parent, A. V., et al. Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection. Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).
- Brehm, M. A., et al. Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression. FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).
- Abdulreda, M. H., et al. In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice. Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).
