Denne protokollen beskriver en enkel og minimalt invasiv metode for transplantasjon og avbildning av NIT-1-celler i ikke-overvektige diabetiske (NOD) -alvorlige kombinerte immundefekte mus utfordret med splenocytter renset fra spontant diabetiske NOD-mus.
Type 1 diabetes er preget av autoimmun ødeleggelse av insulinproducerende beta-celler i bukspyttkjertelen. En lovende behandling for denne sykdommen er transplantasjon av stamcelleavledede betaceller. Genetiske modifikasjoner kan imidlertid være nødvendig for å beskytte de transplanterte cellene mot vedvarende autoimmunitet. Diabetiske musemodeller er et nyttig verktøy for foreløpig evaluering av strategier for å beskytte transplanterte celler mot autoimmunt angrep. Beskrevet her er en minimalt invasiv metode for transplantasjon og avbildning av celletransplantater i en adoptiv overføringsmodell av diabetes hos mus. I denne protokollen transplanteres celler fra murine pankreas betacellelinje NIT-1 som uttrykker firefly luciferase transgene luc2 subkutant i immundefekte ikke-overvektige diabetiske (NOD)-alvorlige kombinerte immundefekte (scid) mus. Disse musene injiseres samtidig intravenøst med splenocytter fra spontant diabetiske NOD-mus for å overføre autoimmunitet. Transplantatene avbildes med jevne mellomrom via ikke-invasiv bioluminescerende avbildning for å overvåke celleoverlevelsen. Overlevelsen til mutante celler sammenlignes med overlevelsen til kontrollceller transplantert i samme mus.
Type 1 diabetes (T1D) er forårsaket av autoimmun ødeleggelse av insulinproduserende betaceller i bukspyttkjertelen. Tapet av beta-cellemasse resulterer i insulinmangel og hyperglykemi. T1D-pasienter er avhengige av flere daglige injeksjoner av eksogent insulin og opplever episoder med alvorlig hyperglykemi og hypoglykemi gjennom hele livet. Komplikasjonene knyttet til disse episodene inkluderer diabetisk retinopati, nedsatt nyrefunksjon og nevropati1.
Insulininjeksjoner er en behandling, men ikke en kur for T1D. Erstatning av den tapte beta-cellemassen har imidlertid potensial til å reversere sykdommen ved å gjøre det mulig for pasienter å produsere sitt eget insulin. Tilgangen på kadaveriske donorholmer er imidlertid begrenset2. Stamcelleavledede øyer (SC-holmer) kan gi en tilnærmet ubegrenset tilførsel av betaceller for transplantasjon. Flere grupper har vist at humane embryonale stamceller (ESC) og induserte pluripotente stamceller (iPSCs) kan differensieres for å generere funksjonelle beta-lignende celler 3,4,5. Lovende data fra tidlige kliniske studier indikerer at disse cellene opprettholder sin funksjon etter transplantasjonen og kan gjøre det mulig for pasienter å bli insulinuavhengige6. Kronisk immunsuppresjon er nødvendig, imidlertid, og dermed øke deres mottakelighet for kreft og infeksjon. I tillegg kan immunsuppressive midler være cytotoksiske for transplantater på lang sikt7. For å eliminere behovet for immunsuppresjon, kan SC-øyer bli genetisk modifisert for å beskytte dem mot tilbakevendende autoimmunitet samt alloimmunitet etter transplantasjon.
Stamcelleforskning er svært krevende i kostnader og arbeidskraft. Musecellelinjer og dyremodeller er nyttige verktøy for første identifisering og eksperimentell validering av strategier for å beskytte transplanterte celler mot autoimmunitet. NOD-musen utvikler spontan autoimmun diabetes med mange likheter med human T1D8, og NIT-1 insulinomcellelinjen deler en genetisk bakgrunn med denne musestammen9. Diabetes kan overføres adoptivt til den relaterte immundefekte NOD-scid-musestammen via injeksjon av diabetiske splenocytter fra NOD-mus for å tidsmessig synkronisere utbruddet av diabetes i replikere eksperimentelle mus10. Denne modellen kan brukes til å identifisere genetiske mål relativt raskt og billig for videre validering i SC-øyer. Nylig ble metoden brukt til å identifisere og validere RNLS, et mål som ble funnet å beskytte primære menneskelige øyer fra autoimmunitet in vivo og iPSC-avledede øyer fra betacellestress in vitro11. Beskrevet her er en enkel protokoll for å transplantere genetisk konstruerte NIT-1-celler og ikke-invasivt overvåke deres overlevelse i en adoptivoverføringsmodell av autoimmun diabetes hos mus.
T1D er en ødeleggende sykdom som det for tiden ikke finnes noen kur for. Betacelleerstatningsterapi tilbyr en lovende behandling for pasienter med denne sykdommen, men den kritiske barrieren for denne strategien er potensialet for tilbakevendende autoimmunt angrep mot de transplanterte betacellene. Genteknologien til SC-beta-celler for å redusere immunsynligheten eller følsomheten er en potensiell løsning på dette problemet. Beskrevet her er en protokoll for ikke-invasivt avbildning transplanterte beta-celler for å…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Erica P. Cai og Dr. Yuki Ishikawa for å ha utviklet metoden beskrevet i denne protokollen (se ref. 11). Forskning i SK og PY laboratorier støttes av tilskudd fra National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Harvard Stem Cell Institute og Beatson Foundation. TS ble støttet av et postdoktorstipend fra National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45), og KB ble støttet delvis av et stipend fra Mary K. Iacocca Foundation.
0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |