Summary

लाल रक्त कोशिका प्रोटीन में गतिशील परिवर्तनों का इम्यूनोस्टेनिंग-आधारित पता लगाना

Published: March 17, 2023
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Summary

एन्यूक्लिएटेड लाल रक्त कोशिकाओं के प्रोटीन सक्रियण में गतिशील परिवर्तनों को कैप्चर करना पद्धतिसंबंधी चुनौतियों का सामना करता है, जैसे कि बाद के मूल्यांकन के लिए तीव्र उत्तेजनाओं में गतिशील परिवर्तनों का संरक्षण। प्रस्तुत प्रोटोकॉल नमूना तैयारी और धुंधला तकनीकों का वर्णन करता है जो प्रासंगिक प्रोटीन परिवर्तनों और बाद में पता लगाने के संरक्षण और विश्लेषण को सक्षम करता है।

Abstract

लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) प्रोटीन की एंटीबॉडी लेबलिंग समग्र प्रोटीन सामग्री में परिवर्तन या प्रोटीन सक्रियण राज्यों में तीव्र परिवर्तन का पता लगाने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली, अर्ध-मात्रात्मक विधि है। यह आरबीसी उपचार के मूल्यांकन, कुछ रोग राज्यों में मतभेदों के लक्षण वर्णन और सेलुलर कोहेरेंस के विवरण की सुविधा प्रदान करता है। तीव्र रूप से परिवर्तित प्रोटीन सक्रियण का पता लगाने के लिए (उदाहरण के लिए, मेकेनोट्रांसडक्शन के माध्यम से) अन्यथा अस्थायी प्रोटीन संशोधनों को संरक्षित करने के लिए पर्याप्त नमूना तैयारी की आवश्यकता होती है। मूल सिद्धांत में विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रारंभिक बंधन को सक्षम करने के लिए वांछित आरबीसी प्रोटीन के लक्ष्य बाध्यकारी साइटों को स्थिर करना शामिल है। द्वितीयक एंटीबॉडी को संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी से बांधने के लिए इष्टतम परिस्थितियों की गारंटी देने के लिए नमूना को आगे संसाधित किया जाता है। गैर-फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी के चयन के लिए अतिरिक्त उपचार की आवश्यकता होती है, जिसमें बायोटिन-एविडिन युग्मन और धुंधला विकसित करने के लिए 3,3-डायमिनोबेंज़िडाइन-टेट्राहाइड्रोक्लोराइड (डीएबी) का आवेदन शामिल है, जिसे ऑक्सीकरण को रोकने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत वास्तविक समय में नियंत्रित करने की आवश्यकता होती है, और इस प्रकार समय पर तीव्रता को धुंधला करना पड़ता है। धुंधला तीव्रता का पता लगाने के लिए, छवियों को एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लिया जाता है। इस प्रोटोकॉल के संशोधन में, इसके बजाय एक फ्लोरेसिन-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी लागू किया जा सकता है, जिसका लाभ यह है कि कोई और विकास कदम आवश्यक नहीं है। हालांकि, इस प्रक्रिया को धुंधला पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोप से जुड़े प्रतिदीप्ति उद्देश्य की आवश्यकता होती है। इन विधियों की अर्ध-मात्रात्मक प्रकृति को देखते हुए, गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं और पृष्ठभूमि संकेतों के लिए कई नियंत्रण दाग प्रदान करना अनिवार्य है। यहां, हम विभिन्न धुंधला तकनीकों के संबंधित परिणामों और लाभों की तुलना और चर्चा करने के लिए धुंधला प्रोटोकॉल और संबंधित विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं दोनों को प्रस्तुत करते हैं।

Introduction

लाल रक्त कोशिकाएं (आरबीसी) 70 से 140 दिनों के लिए कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम को पार करती हैं, जिसमें लगभग 115 दिनों की औसत आरबीसी आयु 1,2 होती है। सेनेसेंट या क्षतिग्रस्त आरबीसी को एरिथ्रोफागोसाइटोसिस द्वारा परिसंचरण से हटा दिया जाता है, मैक्रोफेज3 द्वारा संचालित एक कुशल समाशोधन प्रक्रिया। इन कोशिकाओं का पूर्व निर्धारित जीवनकाल विभेदन और परिपक्वता के दौरान नाभिक, माइटोकॉन्ड्रिया और राइबोसोम सहित सेल ऑर्गेनेल को आत्मसमर्पण करने का एक परिणामहै। इस प्रकार, परिसंचारी आरबीसी एक ट्रांसलेशनल मशीनरी से रहित होते हैं, जोनए प्रोटीन 3 के संश्लेषण को प्रभावित करते हैं। यह इस प्रकार है कि मौजूदा प्रोटीन में गतिशील, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन आरबीसी5 पर कार्य करने वाले बाह्य और इंट्रासेल्युलर तनावों के जवाब में तीव्र, जैव रासायनिक विनियमन के एकमात्र व्यवहार्य तंत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं।

यांत्रिक बल मुख्य बाह्य संकेत प्रतीत होते हैं जो आरबीसी के भीतर जैव रासायनिक मार्गों के सक्रियण या मॉड्यूलेशन का कारण बनते हैं। आरबीसी झिल्ली6 में मेकेनोसेंसेटिव प्रोटीन, पीज़ो 1 की खोज नेइन कोशिकाओं में यांत्रिक रूप से सक्रिय सिग्नलिंग की जांच करने वाले अनुसंधान की कई पंक्तियों को प्रेरित किया। उदाहरण के लिए, हाल की प्रगति से पता चला है कि आरबीसी के भौतिक गुणों को प्रोटीन8 के तीव्र और गतिशील परिवर्तनों द्वारा सक्रिय रूप से विनियमित किया जाता है, जिसमें पोस्ट-ट्रांसलेशनल फॉस्फोराइलेशन और सर्वव्यापी9 शामिल हैं। चूंकि ये सामान्य संशोधन कुछ बीमारियों 9,10,11 में भिन्न होते हैं, इसलिए आरबीसी प्रोटीन की सक्रियण स्थिति को निर्धारित करने के लिए वैज्ञानिक और नैदानिक रुचि प्रतीत होती है, विशेष रूप से मेकेनोबायोलॉजिकल प्रक्रियाओं के संबंध में।

आरबीसी प्रोटीन सक्रियण राज्यों में तीव्र परिवर्तनों का निर्धारण कुछ पद्धतिगत चुनौतियां पैदा करता है। उदाहरण के लिए, बाद के विश्लेषण के लिए आरबीसी नमूनों के भंडारण के लिए संशोधित आरबीसी प्रोटीन के संरक्षण की आवश्यकता होती है, क्योंकि पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन गैर-टिकाऊ होते हैं। इसके अलावा, क्लासिक प्रोटीन-डिटेक्शन विधियों (जैसे, पश्चिमी सोख्ता) हीमोग्लोबिन के सापेक्ष प्रोटीन की कम प्रचुरता के कारण आरबीसी में मानकीकृत करना मुश्किल है, जोइन कोशिकाओं में प्रोटीन सामग्री का ~ 98% है। इस प्रकार, रासायनिक रूप से संरक्षित आरबीसी का एंटीबॉडी-आधारित धुंधलापन महत्वपूर्ण आरबीसी प्रोटीन के तीव्र संशोधनों की जांच करते समय पसंद की विधि रही है, जैसे कि नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (आरबीसी-एनओएस) 13,14 के आरबीसी-विशिष्ट आइसोफॉर्म। आरबीसी-एनओएस को एंजाइमेटिक रूप से नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है, जो आरबीसी विकृति15,16,17 सहित आवश्यक आरबीसी गुणों के लिए अपरिहार्य लगता है। आरबीसी-एनओएस के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन उत्प्रेरक एंजाइम गतिविधि को नियंत्रित करते हैं, जिसमें एंजाइम गतिविधि को बढ़ाने के लिए सेरीन 1177 अवशेषों के फॉस्फोराइलेशन का वर्णन किया जाता है, जबकि अवशेषों सेरीन 114 या थ्रेओनिन 495 के फॉस्फोराइलेशन को आरबीसी-एनओएस गतिविधि18,19 में कमी के साथ जोड़ा गया है।

सामूहिक रूप से, आरबीसी प्रोटीन के अस्थायी संशोधन महत्वपूर्ण सेलुलर फ़ंक्शन में योगदान करते हैं, और मानकीकृत प्रोटोकॉल जो इन संशोधित प्रोटीनों का पता लगाने में सक्षम होते हैं, उच्च मूल्य के होते हैं। यहां, हम दो अलग-अलग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो आरबीसी-एनओएस प्रोटीन सक्रियण का पता लगाने की सुविधा के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का फायदा उठाते हैं, और डेटा विश्लेषण और व्याख्या के लिए सिफारिशों पर चर्चा करते हैं।

वर्णित प्रोटोकॉल के प्रदर्शन का मूल्यांकन मानव वाहिका (5 पीए) के भीतर होने वाले यांत्रिक बलों के जवाब में सेरीन 1177 अवशेषों पर आरबीसी-एनओएस के फॉस्फोराइलेशन में अच्छी तरह से रिपोर्ट की गई वृद्धि को मापकर किया गया था।

Protocol

यहां वर्णित प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा के साथ संरेखण में हैं और जर्मन स्पोर्ट्स यूनिवर्सिटी कोलोन (9/16/2013) और ग्रिफिथ विश्वविद्यालय (2019/808) की नैतिकता समितियों द्वारा अनुमोदित किए गए थे। स्वयंसेवकों को प…

Representative Results

प्रस्तुत प्रोटोकॉल, उन तरीकों का वर्णन करता है जो आरबीसी प्रोटीन में तीव्र परिवर्तनों का पता लगाने की सुविधा प्रदान करते हैं, एक प्रसिद्ध यांत्रिक रूप से संवेदनशील प्रोटीन परिवर्तन पर परीक्षण किया ग?…

Discussion

हाल के साहित्य से पता चलता है कि आरबीसी-एनओएस प्रोटीन आरबीसी विकृति15,22,23 के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है, जो बदले में संकीर्ण केशिकाओं 24 के माध्यम से उनके पारित</s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

एलके एक ऑस्ट्रेलियाई सरकार अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम छात्रवृत्ति के समर्थन को स्वीकार करता है।

Materials

3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate Sigma/Merck D5637 DAB
Ammoniumchloride  Merck /Millipore 101145 NH4Cl
Centrifuge 5427 R  Eppendorf 5409000010
Coverslips VWR 631-0147 
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate  Merck /Millipore 106580 Na2HPO4. 2 H2O
Disposable transfer pipettes VWR 612-6803
Entellan Merck /Millipore 107961 rapid mounting medium for microscopy
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) Hofmann 642
Glucose-Oxidase Sigma/Merck G2133
Grease pencil  Dako S 2002
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase Sigma/Merck E-2886 HRP
Hydrochloric acid  Merck /Millipore 109057 HCl
Hydrogen peroxide, 30% Merck /Millipore 107203 H2O2
ImageJ Software Freeware
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) RR Mechatronics Ektacytometer instrument used for shearing
Methanol Merck /Millipore 106009
Microscope slides VWR 630-1985
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate  Sigma/Merck N4882 NiSO4.6H2O
Normal Goat serum Agilent/DAKO X0907 NGS
Paraformaldehyde Merck /Millipore 818715 PFA
Pipettes Eppendorf Reference 2 VWR 613-5836/ 613-5839
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) Merck/Millipore 07-428-I Primary Antibody
Reaction tubes, 2ml Eppendorf 30120094
Secondary Antibody goat anti rabbit Agilent/DAKO E0432 Secondary Antibody
Skim milk powder Bio-Rad 170-6404
Sodium chloride  Merck /Millipore 106404 NaCl
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate Merck /Millipore 106346 NaH2PO4.H2O
Sodium hydroxide, 1 M Merck /Millipore 150706 NaOH
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Merck /Millipore 108382 Tris
Trypsin Sigma/Merck T7409
Tween20  Merck /Millipore 822184
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F Merck /Millipore WHA1825047
Xylol VWR Chemicals 2,89,73,465
ß-D-Glucose monohydrate Merck /Millipore 14431-43-7

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check_url/it/64843?article_type=t

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Citazione di questo articolo
Grau, M., Kuck, L. Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins. J. Vis. Exp. (193), e64843, doi:10.3791/64843 (2023).

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