赤血球タンパク質の動的変化の免疫染色ベースの検出
Summary
除核された赤血球のタンパク質活性化の動的変化を捉えることは、後の評価のために急性刺激に対する動的変化を保存するなど、方法論的な課題をもたらします。提示されたプロトコルは、関連するタンパク質変化の保存と分析、およびその後の検出を可能にするサンプル調製および染色技術について説明しています。
Abstract
赤血球(RBC)タンパク質の抗体標識は、全体的なタンパク質含有量の変化やタンパク質活性化状態の急激な変化を検出するために一般的に使用される半定量的な方法です。これにより、赤血球治療の評価、特定の病状の違いの特性評価、および細胞コヒーレンシーの説明が容易になります。急性に変化したタンパク質活性化(メカノトランスダクションなど)の検出には、一時的なタンパク質修飾を保存するための適切なサンプル調製が必要です。基本原理は、特異的一次抗体の初期結合を可能にするために、所望のRBCタンパク質の標的結合部位を固定化することを含む。サンプルは、二次抗体が対応する一次抗体に結合するための最適条件を保証するためにさらに処理されます。非蛍光二次抗体の選択には、ビオチン-アビジンカップリングや染色を開発するための3,3-ジアミノベンジジン-四塩酸塩(DAB)の適用など、追加の処理が必要であり、酸化を停止し、染色強度を時間通りに停止させるために顕微鏡下でリアルタイムで制御する必要があります。染色強度検出のために、画像は標準的な光学顕微鏡を用いて撮影される。このプロトコルの改変では、フルオレセイン標識二次抗体を代わりに適用することができ、これはさらなる開発ステップを必要としないという利点を有する。ただし、この手順では、染色検出のために顕微鏡に取り付けられた蛍光対物レンズが必要です。これらのメソッドの半定量的な性質を考えると、非特異的抗体反応とバックグラウンドシグナルを説明するために、いくつかのコントロール染色剤を提供することが不可欠です。ここでは、染色プロトコルと対応する分析プロセスの両方を提示し、さまざまな染色技術のそれぞれの結果と利点を比較および説明します。
Introduction
赤血球(RBC)は心血管系を70〜140日間横断し、平均赤血球年齢は約115日です1,2。老化または損傷した赤血球は、マクロファージ3によって駆動される効率的な透明化プロセスである赤血球貪食によって循環から除去されます。これらの細胞の所定の寿命は、分化および成熟中に核、ミトコンドリア、およびリボソームを含む細胞小器官を放棄することの1つの結果である4。したがって、循環する赤血球は翻訳機構を欠いており、新しいタンパク質の合成を妨げています3。したがって、既存のタンパク質に対する動的な翻訳後修飾は、赤血球に作用する細胞外および細胞内ストレッサーに応答する急性の生化学的調節の唯一の実行可能なメカニズムを表しています5。
機械的な力は、赤血球内の生化学的経路の活性化または調節を引き起こす主要な細胞外手がかりであるように思われます。赤血球膜6における機械感受性タンパク質Piezo1の発見は、これらの細胞における機械的に活性化されたシグナル伝達を調査するいくつかの研究ラインに影響を与えました7。例えば、最近の進歩により、赤血球の物理的特性は、翻訳後リン酸化やユビキチン化を含むタンパク質8の急性かつ動的な変化によって活発に制御されていることが示されています9。これらの正常な修飾は特定の疾患で異なるため9,10,11、特にメカノバイオロアプロセスに関連して、RBCタンパク質の活性化状態を決定することは科学的および臨床的に興味深いようです。
赤血球タンパク質活性化状態の急激な変化の決定は、いくつかの方法論的課題をもたらします。例えば、後の分析のために赤血球サンプルを保存するには、翻訳後修飾は耐久性がないため、修飾された赤血球タンパク質を保存する必要があります。さらに、従来のタンパク質検出法(ウェスタンブロッティングなど)は、これらの細胞のタンパク質含有量の~98%を占めるヘモグロビンに比べてタンパク質の存在量が少ないため、赤血球で標準化することが難しいことで有名です12。したがって、化学的に保存された赤血球の抗体ベースの染色は、一酸化窒素合成酵素の赤血球特異的アイソフォーム(RBC-NOS)などの重要な赤血球タンパク質の急性修飾を調べる際に選択される方法となっています13,14。RBC-NOSは一酸化窒素(NO)を酵素的に生成することが示されており、これはRBC変形能を含む必須のRBC特性に不可欠であると思われる15,16,17。RBC-NOSの翻訳後修飾は触媒酵素活性を調節し、セリン1177残基のリン酸化は酵素活性を増加させると記載されているが、セリン114またはスレオニン495残基のリン酸化はRBC-NOS活性の低下と関連している18,19。
全体として、RBCタンパク質の一時的な修飾は重要な細胞機能に寄与し、これらの修飾タンパク質の検出を可能にする標準化されたプロトコルは高い価値があります。ここでは、RBC-NOSタンパク質活性化の検出を容易にするために特異的抗体を利用する2つの異なるプロトコルを提示し、データ分析と解釈のための推奨事項について説明します。
記載されたプロトコルの性能は、ヒト血管系内で起こるものを反映する機械的力(5Pa)に応答して、セリン1177残基におけるRBC−NOSのリン酸化のよく報告された増加を測定することによって評価した。
Protocol
Representative Results
Discussion
最近の文献は、RBC-NOSタンパク質がRBC変形能の調節にとって決定的に重要であることを強く示唆しており15,22,23、その結果、狭い毛細血管を通過することが促進されます24。タンパク質活性は、翻訳後タンパク質修飾、特に特定の残基のリン酸化に大きく依存します18。関心の焦点は、RBC?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LKは、オーストラリア政府の研究トレーニングプログラム奨学金の支援を認めています。
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
Riferimenti
- Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
- Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
- Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die?. Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
- Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
- Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
- Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
- Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
- Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
- Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
- Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
- Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
- Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
- Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
- Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
- Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
- Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
- Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biologia. 10 (1), 47 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
- Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
- McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
- Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
- Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
- Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
- Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
- Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
- Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
- Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
- Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
- Feelisch, M. . Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).
