Detecção de Alterações Dinâmicas em Proteínas Eritrocitárias Baseadas em Imunomarcação
Summary
A captação de mudanças dinâmicas na ativação proteica de hemácias enucleadas apresenta desafios metodológicos, como a preservação de alterações dinâmicas em estímulos agudos para posterior avaliação. O protocolo apresentado descreve técnicas de preparo e coloração de amostras que permitem a preservação e análise de alterações proteicas relevantes e posterior detecção.
Abstract
A marcação de anticorpos de proteínas eritrocitárias é um método semiquantitativo comumente usado para detectar mudanças no conteúdo global de proteínas ou alterações agudas em estados de ativação proteica. Facilita a avaliação de tratamentos eritrocitários, a caracterização de diferenças em determinados estados patológicos e a descrição de coerências celulares. A detecção de ativação proteica agudamente alterada (por exemplo, através de mecanotransdução) requer preparação adequada da amostra para preservar modificações proteicas temporárias. O princípio básico inclui a imobilização dos sítios de ligação alvo das proteínas eritrocitárias desejadas para permitir a ligação inicial de anticorpos primários específicos. A amostra é posteriormente processada para garantir condições ideais para a ligação do anticorpo secundário ao anticorpo primário correspondente. A seleção de anticorpos secundários não fluorescentes requer tratamento adicional, incluindo o acoplamento biotina-avidina e a aplicação de 3,3-diaminobenzidina-tetracloridrato (DAB) para desenvolver a coloração, que precisa ser controlada em tempo real sob um microscópio para interromper a oxidação e, assim, colorir a intensidade a tempo. Para a detecção da intensidade da coloração, as imagens são obtidas usando um microscópio de luz padrão. Em uma modificação deste protocolo, um anticorpo secundário conjugado à fluoresceína pode ser aplicado em seu lugar, o que tem a vantagem de que nenhuma etapa adicional de desenvolvimento é necessária. Este procedimento, no entanto, requer uma objetiva de fluorescência acoplada a um microscópio para detecção da coloração. Dada a natureza semiquantitativa desses métodos, é imperativo fornecer várias colorações de controle para explicar reações de anticorpos inespecíficos e sinais de fundo. Aqui, apresentamos os protocolos de coloração e os processos analíticos correspondentes para comparar e discutir os respectivos resultados e vantagens das diferentes técnicas de coloração.
Introduction
As hemácias (hemácias) atravessam o sistema cardiovascular por 70 a 140 dias, com idade média das hemácias de aproximadamente 115 dias 1,2. As hemácias senescentes ou lesadas são removidas da circulação por eritrofagocitose, um eficiente processo de clareamento conduzido por macrófagos3. O tempo de vida predeterminado dessas células é uma consequência da entrega das organelas celulares, incluindo o núcleo, as mitocôndrias e os ribossomos, durante a diferenciação e maturação4. Assim, as hemácias circulantes são desprovidas de maquinaria translacional, impossibilitando a síntese de novas proteínas3. Conclui-se que modificações dinâmicas e pós-traducionais em proteínas existentes representam o único mecanismo viável de regulação bioquímica aguda em resposta a estressores extracelulares e intracelulares que atuam sobre as hemácias5.
As forças mecânicas parecem ser as principais pistas extracelulares que causam a ativação ou modulação de vias bioquímicas dentro das hemácias. A descoberta da proteína mecanossensível, Piezo1, em membranas eritrocitárias6 inspirou várias linhas de pesquisa investigando a sinalização ativada mecanicamente nessas células7. Por exemplo, avanços recentes têm mostrado que as propriedades físicas das hemácias são ativamente reguladas por mudanças agudas e dinâmicas das proteínas8, o que inclui fosforilação pós-traducional e ubiquitinação9. Como essas modificações normais diferem em certas doenças 9,10,11, parece ser de interesse científico e clínico determinar o estado de ativação das proteínas eritrocitárias, especificamente em relação aos processos mecanobiológicos.
A determinação de alterações agudas nos estados de ativação de proteínas eritrocitárias apresenta alguns desafios metodológicos. Por exemplo, o armazenamento de amostras de hemácias para análise posterior requer a preservação das proteínas eritrocitárias modificadas, uma vez que as modificações pós-traducionais não são duráveis. Além disso, os métodos clássicos de detecção de proteínas (por exemplo, western blotting) são notoriamente difíceis de padronizar em hemácias devido à baixa abundância de proteínas em relação à hemoglobina, que responde por ~98% do conteúdo proteico nessas células12. Assim, a coloração de hemácias quimicamente preservadas com base em anticorpos tem sido o método de escolha na investigação de modificações agudas de importantes proteínas eritrocitárias, como a isoforma eritrocitária específica da óxido nítrico sintase (RBC-NOS)13,14. Demonstrou-se que as hemácias-NOS produzem enzimaticamente óxido nítrico (NO), o que parece indispensável para propriedades essenciais das hemácias, incluindo a deformabilidade das hemácias15,16,17. Modificações pós-traducionais de RBC-NOS regulam a atividade enzimática catalítica, com a fosforilação do resíduo de serina 1177 sendo descrita para aumentar a atividade enzimática, enquanto a fosforilação dos resíduos serina 114 ou treonina 495 tem sido associada à diminuição da atividade de RBC-NOS18,19.
Coletivamente, modificações temporárias de proteínas eritrocitárias contribuem para importante função celular, e protocolos padronizados que permitem a detecção dessas proteínas modificadas são de alto valor. Aqui, apresentamos dois protocolos distintos que exploram anticorpos específicos para facilitar a detecção da ativação da proteína eritrocitária-NOS, e discutimos recomendações para análise e interpretação dos dados.
O desempenho dos protocolos descritos foi avaliado medindo-se o aumento bem relatado na fosforilação de eritrócitos-NOS no resíduo de serina 1177 em resposta a forças mecânicas reflexivas daquelas que ocorrem dentro da vasculatura humana (5 Pa).
Protocol
Representative Results
Discussion
A literatura recente sugere que a proteína RBC-NOS é de fundamental importância para a regulação da deformabilidade das hemácias 15,22,23, o que, por sua vez, facilita sua passagem por capilares estreitos 24. A atividade proteica depende fortemente de modificações proteicas pós-traducionais, particularmente da fosforilação de certos resíduos18. O foco de interesse est?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A LK reconhece o apoio de uma bolsa do Programa de Treinamento em Pesquisa do Governo Australiano.
Materials
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
Riferimenti
- Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
- Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
- Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die?. Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
- Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
- Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
- Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
- Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
- Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
- Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
- Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
- Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
- Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
- Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
- Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
- Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
- Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
- Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biologia. 10 (1), 47 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
- Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
- McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
- Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
- Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
- Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
- Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
- Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
- Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
- Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
- Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
- Feelisch, M. . Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).
