Studio della biologia e del metabolismo dei grassi beige utilizzando il sistema di attivazione CRISPR SunTag-p65-HSF1
Summary
Questo protocollo presenta l’uso di CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) negli adipociti (AdipoSPH) come strategia alternativa al virus adeno-associato (AAV) per studiare la biologia del grasso beige. L’iniezione in vivo di sgRNA portatori di AAV mirati al gene endogeno Prdm16 è sufficiente per indurre lo sviluppo di grasso beige e migliorare il programma genico termogenico.
Abstract
La tecnologia CRISPR (Clustered regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ha provocato una rivoluzione in biologia e strumenti recenti sono stati applicati ben oltre l’editing genetico originariamente descritto. Il sistema di attivazione CRISPR (CRISPRa) combina la proteina Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) con moduli di trascrizione distinti per indurre l’espressione genica endogena. SunTag-p65-HSF1 (SPH) è una tecnologia CRISPRa di recente sviluppo che combina componenti di mediatori di attivazione sinergica (SAM) con gli attivatori SunTag. Questo sistema consente la sovraespressione di geni singoli o multipli progettando un RNA a guida singola personalizzato (sgRNA). In questo studio, un topo SPH precedentemente sviluppato è stato utilizzato per generare un topo condizionale che esprime SPH negli adipociti (linea di adiponectina Cre), chiamato AdipoSPH. Per indurre un fenotipo di grasso bianco-beige (imbrunimento), un virus adeno-associato (AAV) che trasporta sgRNA mirato al gene endogeno Prdm16 (un fattore di trascrizione ben consolidato correlato allo sviluppo del grasso bruno e beige) è stato iniettato nel tessuto adiposo bianco inguinale (iWAT). Questo modello murino ha indotto l’espressione di Prdm16 endogeno e ha attivato il programma genico termogenico. Inoltre, la sovraespressione di Prdm16 indotta da SPH in vitro ha migliorato il consumo di ossigeno degli adipociti beige, fenocopiando i risultati di un precedente modello murino transgenico Prdm16. Pertanto, questo protocollo descrive un modello murino versatile, economico ed efficiente in termini di tempo per studiare la biologia del tessuto adiposo.
Introduction
Gli adipociti beige (o brite) sono adipociti disaccoppianti che esprimono la proteina 1 (UCP1) e ricchi di mitocondri che risiedono all’interno di depositi di tessuto adiposo bianco (WAT). Il grasso beige emerge da un sottogruppo di progenitori adipocitari o adipociti bianchi maturi in risposta all’esposizione al freddo e ad altri stimoli 1,2. Gli adipociti beige possono convertire l’energia in calore in modo UCP1-dipendente o indipendente3. Indipendentemente dalla sua funzione termogenica, il grasso beige può anche migliorare la salute metabolica con altri mezzi, come la secrezione di adipochine e attività antinfiammatorie e antifibrotiche. Studi su topi e umani hanno dimostrato che l’induzione del grasso beige migliora il glucosio di tutto il corpo e l’omeostasi lipidica3. Tuttavia, sebbene la nostra conoscenza della biologia del grasso beige si sia evoluta rapidamente negli ultimi anni, la maggior parte dei suoi benefici metabolici e dei relativi meccanismi non sono ancora completamente compresi.
Le brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) sono state descritte per la prima volta nelle cellule eucariotiche come uno strumento in grado di generare una rottura del doppio filamento (DSB) in un sito specifico del genoma attraverso l’attività nucleasica della proteina Cas9 4,5. Cas9 è guidato da un RNA sintetico a guida singola (sgRNA) per colpire una specifica regione genomica, portando a un DSB del DNA. Oltre a utilizzare la nucleasi Cas9 per scopi di editing, la tecnologia CRISPR-Cas9 si è evoluta per essere utilizzata come strumento di regolazione genica specifico per sequenza6. Lo sviluppo di una proteina Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) e l’associazione di moduli trascrizionali in grado di migliorare l’espressione genica ha dato origine a strumenti di attivazione di CRISPR (CRISPRa). Sono emersi diversi sistemi CRISPRa, come VP647,8, mediatore di attivazione sinergica (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 e SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, che combina i componenti degli attivatori SAM e SunTag. Recentemente è stato dimostrato che l’espressione indotta di geni neurogeni nei neuroblasti N2a e negli astrociti primari è maggiore utilizzando SPH rispetto ad altri sistemi CRISPRa14, dimostrando SPH come un promettente strumento CRISPRa.
Qui, abbiamo sfruttato un topo SPH14 sviluppato in precedenza per generare un modello murino condizionale che esprime SPH specificamente negli adipociti utilizzando il lignaggio dell’adiponectina Cre (AdipoSPH). Utilizzando un virus adeno-associato (AAV) che trasporta il gRNA che ha come bersaglio il gene endogeno Prdm16, l’imbrunimento (conversione da bianco a beige) di WAT inguinale (iWAT) è stato indotto per aumentare l’espressione del programma genico termogenico. Inoltre, la sovraespressione in vitro di Prdm16 ha aumentato il consumo di ossigeno. Pertanto, questo protocollo fornisce un versatile modello murino SPH per esplorare i meccanismi di sviluppo del grasso beige all’interno del tessuto adiposo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una delle applicazioni non-editing più utili della tecnologia CRISPR è l’interrogazione della funzione genica attraverso l’attivazione di geni endogeni utilizzando i sistemi CRISPRa6. SPH è un potente CRISPRa che è stato originariamente descritto per indurre la conversione degli astrociti in neuroni attivi prendendo di mira diversi geni neurogeni14. In questo studio, AdipoSPH ha dimostrato di essere uno strumento adatto per studiare la biologia del grasso beige attivand…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il supporto ricevuto dal Centro Multidisciplinare para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, per la generazione di topi AdipoSPH, il Laboratorio di Inmmunometabolismo e Segnalazione Cellulare e l’Istituto Nazionale di Scienza e Tecnologia sulla Fotonica Applicata alla Biologia Cellulare (INFABIC) per tutto il supporto sperimentale. Ringraziamo il sostegno finanziario della Fondazione di ricerca di San Paolo (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
Riferimenti
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