Qui, presentiamo un protocollo di coltura 3D efficace, facile e veloce per la formazione di sferoidi di due linee cellulari di zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrione) e ZFL (epatocita normale).
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Articolo metodologico
Un metodo di coltura 3D di sferoidi di linee cellulari embrionali e epatiche di zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le linee cellulari di pesce sono promettenti modelli in vitro per la valutazione dell'ecotossicità; tuttavia, i sistemi di coltura monostrato convenzionali (coltura 2D) hanno limitazioni ben note (ad esempio, la longevità della coltura e il mantenimento di alcune funzioni cellulari in vivo ). Pertanto, sono state proposte colture 3D, come gli sferoidi, poiché questi modelli possono riprodurre strutture simili a tessuti, ricatturando meglio le condizioni in vivo . Questo articolo descrive un protocollo di coltura 3D efficace, facile e veloce per la formazione di sferoidi con due linee cellulari di zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrione) e ZFL (epatocita normale). Il protocollo consiste nel placcare le celle in una piastra a 96 pozzetti con attacco a fondo tondo, ultra-basso. Dopo 5 giorni sotto scuotimento orbitale (70 giri / min), si forma un singolo sferoide per pozzetto. Gli sferoidi formati presentano dimensioni e forma stabili, e questo metodo evita la formazione di più sferoidi in un pozzo; Pertanto, non è necessario selezionare a mano sferoidi di dimensioni simili. La facilità, la velocità e la riproducibilità di questo metodo sferoidale lo rendono utile per test in vitro ad alta produttività.
Introduzione
Gli sferoidi sono piccole sfere di cellule formate quando le cellule vengono coltivate in stretto contatto cellula-cellula in coltura 3D. La capacità degli sferoidi di imitare l'ambiente tissutale in vivo è già stata studiata in una varietà di linee cellulari e cellule primarie 1,2. Tuttavia, sebbene gli sferoidi siano ben sviluppati per gli studi di tossicità sui mammiferi, lo sviluppo di sferoidi per studi di tossicità con vertebrati non mammiferi (ad esempio pesci) è ancora in corso3. Per le linee cellulari di pesce, gli sferoidi sono stati sviluppati con una varietà di meto....
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Protocollo
I passaggi chiave per generare sferoidi 3D di linee cellulari ZFL e ZEM2S in una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo sono presentati nella Figura 1.
NOTA: vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali utilizzati in questo protocollo e la Tabella 1 per le soluzioni e i terreni di coltura utilizzati in questo protocollo.
1. Terreno di coltura cellulare e colture monostrato
- Coltiva entrambe le linee cellulari (ZFL, ZEM2S) come monostrati in un incubatore a 28 ° C senza CO2 e sottocolt....
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Risultati
I singoli sferoidi per pozzetto con dimensioni e forma stabili sono formati con questo metodo. La Figura 2 illustra il processo di formazione di singoli sferoidi di cellule ZFL e ZEM2S in un pozzetto di una piastra ULA sotto scuotimento orbitale (70 rpm). Le linee cellulari ZFL e ZEM2S hanno comportamenti diversi nella coltura 3D. La linea cellulare ZEM2S presenta caratteristiche che conferiscono la capacità di formare prontamente una forma sferoidale fin dal primo giorno dello scuotimento o.......
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Discussione
Questo è un metodo semplice, facile e veloce per generare sferoidi di fegato zebrafish e linee cellulari embrionali. Questo metodo è stato sviluppato da questo gruppo sulla base di modifiche dei metodi sferoidi 3D esistenti per superare i problemi riportati negli studi scientifici relativi alla formazione di sferoidi, nonché le incertezze nell'accuratezza dei dati dai saggi sferoidi 3D. Ad esempio, i problemi segnalati risiedono nelle difficoltà di manipolazione, nella natura dispendiosa in termini di tempo della generaz.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
In memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautore di questo lavoro, eccellente ricercatore nel campo della cosmesi e dedito alla promozione della ricerca cosmetica in Brasile. Gli autori sono grati al Laboratorio Multiutente del Dipartimento di Fisiologia (UFPR) per la disponibilità delle attrezzature e per il sostegno finanziario del Coordinamento per il miglioramento del personale dell'istruzione superiore (CAPES, Brasile) (Codice finanziario 001) e del Grupo Boticário.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Micropiastra a fondo rotondo trasparente a 96 pozzetti, con attacco ultrabasso, confezionata singolarmente, con coperchio, sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, polvere, glucosio alto, piruvato | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, polvere | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Elaborazione e analisi delle immagini in Java ( ImageJ) Software 1.52p | National Institutes of Health, USA | Disponibile presso: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, polvere | Gibco | 41300021 | |
| agitatore orbitale... | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm diametro di rotazione |
| Dulbeccos PBS (10x) con calcio e magnesio | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Siero fetale bovino, qualificato, regioni approvate USDA | Gibco | 12657-029 | |
| Bicarbonato di sodio, polvere, bioreagente per biologia molecolare | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Colorazione blu di tripano (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Tripsina-EDTA (0,5%), senza rosso fenolo | Gibco | 15400054 | |
| linea cellulare ZEM2S | ATCC | CRL-2147 | Questa linea cellulare è stata gentilmente donata dal Professor Dr. Michael J. Carvan (Università del Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| Linea cellulare ZFL | BCRJ | 256 |
Riferimenti
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K.
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Ristampe e permessi
