Questo protocollo presenta saggi di citotossicità comunemente usati (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red, e MTT assays) adattati per la valutazione della citotossicità in linee cellulari di embrioni di zebrafish (ZEM2S) e fegato (ZFL) in piastre a 96 pozzetti.
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Articolo metodologico
Saggi di citotossicità con linee cellulari di zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le linee cellulari di pesce sono diventate sempre più utilizzate negli studi di ecotossicità e sono stati proposti saggi di citotossicità come metodi per prevedere la tossicità acuta dei pesci. Pertanto, questo protocollo presenta saggi di citotossicità modificati per valutare la vitalità cellulare in linee cellulari embrionali di zebrafish (Danio rerio) (ZEM2S) e fegato (ZFL) in piastre a 96 pozzetti. Gli endpoint di citotossicità valutati sono l'integrità mitocondriale (saggi Alamar Blue [AB] e MTT), l'integrità della membrana attraverso l'attività esterasi (test CFDA-AM) e l'integrità della membrana lisosomiale (saggio Neutral Red [NR]). Dopo l'esposizione delle sostanze in esame in una piastra a 96 pozzetti, vengono eseguiti i saggi di citotossicità; qui, AB e CFDA-AM vengono eseguiti contemporaneamente, seguiti da NR sulla stessa piastra, mentre il saggio MTT viene eseguito su una piastra separata. Le letture per questi test sono prese per fluorescenza per AB e CFDA-AM e assorbanza per MTT e NR. I saggi di citotossicità eseguiti con queste linee cellulari di pesce possono essere utilizzati per studiare la tossicità acuta delle sostanze chimiche sui pesci.
Introduzione
Le sostanze chimiche devono essere testate per quanto riguarda la loro sicurezza per la salute umana e l'ambiente. I biomarcatori molecolari e cellulari sono stati sempre più considerati nelle valutazioni di sicurezza per prevedere gli effetti sugli organismi viventi da parte di agenzie e/o legislazioni regolatorie (ad esempio, REACH, OCSE, US EPA)1,2, poiché possono precedere l'esito avverso in vivo (ad esempio, interferenza endocrina, risposta immunologica, tossicità acuta, fototossicità)3,4,5,6,7
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Protocollo
NOTA: vedere la Tabella dei materiali per l'elenco dei materiali utilizzati in questo protocollo e la Tabella 1 per la composizione delle soluzioni e dei supporti utilizzati in questo protocollo.
1. Preparazione delle celle ZFL e ZEM2S
- Iniziare con un matraccio T75 di cellule ZFL o ZEM2S con confluenza dell'80%, coltivate nel rispettivo mezzo completo a 28 °C senza CO2.
- Rimuovere il terreno di coltura dal matraccio e lavare le cellule aggiungendo 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x (0,01 M). Aggiungere 3 mL di 1x tripsina (0,05% v/v; 0,5 m....
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Risultati
La Figura 3 mostra le piastre dei saggi AB, CFDA-AM, NR e MTT. Per il saggio AB (Figura 3A), i pozzetti vuoti e i pozzetti con nessun o un numero ridotto di cellule vitali mostrano colore blu e bassa fluorescenza, mentre i pozzetti con un alto numero di cellule vitali sono rosati e presentano alti valori di fluorescenza a causa della trasformazione della resazurina (AB) in resorufin (sostanza rosata) da parte delle cellule vitali. Per il test CFDA-AM, non vi è a.......
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Discussione
I saggi di citotossicità sono ampiamente utilizzati per la valutazione della tossicità in vitro e questo articolo di protocollo presenta quattro saggi di citotossicità comunemente usati modificati per essere eseguiti in linee cellulari di zebrafish (cioè densità cellulare per piastra a 96 pozzetti, tempo di incubazione nel test MTT, deplezione di FBS durante la condizione di esposizione chimica e concentrazione massima accettabile per il SC). Poiché questi saggi quantificano la citotossicità in base a diversi en.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
In memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautore di questo lavoro, eccellente ricercatore nel campo della cosmesi e dedito alla promozione della ricerca cosmetica in Brasile. Gli autori sono grati al Multi-user Laboratory del Dipartimento di Fisiologia (UFPR) per la disponibilità delle attrezzature e per il sostegno finanziario del Coordinamento per il miglioramento del personale dell'istruzione superiore (CAPES, Brasile) (Codice finanziario 001) e del Grupo Boticario.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-CFDA, AM (5-carbossifluoresceina diacetato, acetossimetilestere) | Invitrogen | C1345 | |
| Piastra per colture cellulari, piastra a 96 pozzetti | Sarstedt | 83.3924 | Superficie: Standard, base piatta |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Polvere, glucosio alto, piruvato |
| FBS - Siero bovino fetale, regioni qualificate, approvate dall'USDA | Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, polvere | Gibco | 21700026 | Polvere |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | Polvere |
| Neutro rosso | Sigma-Aldrich | N4638 | Polvere, BioReagente, adatto per colture cellulari |
| Agitatore orbitale | Warmnest | KLD-350-BI | Diametro di rotazione 22 mm |
| Dulbeccos PBS (10X) con calcio e magnesio | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Resazurina sale sodico | Sigma-Aldrich | R7017 | Polvere, BioReagente, adatto per colture cellulari |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | Polvere |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | Polvere, bioreagente per biologia molecolare |
| Tiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Tripsina-EDTA (0,5%), senza rosso fenolo | Gibco | 15400054 | |
| linea cellulare ZEM2S | ATCC | CRL-2147 | Questa linea cellulare è stata gentilmente donata dal Professor Dr. Michael J. Carvan (Università del Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| Linea cellulare ZFL | BCRJ | 256 |
Riferimenti
- ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
- Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from:
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Ristampe e permessi
