न्यूरॉन्स का एक रेडी-टू-यूज़ जमे हुए स्टॉक सिनैप्टिक कार्यों के मूल्यांकन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यहां, हम 96-वेल प्लेट का उपयोग करके जमे हुए स्टॉक से एक आसान कम घनत्व वाली प्राथमिक संस्कृति पेश करते हैं।
न्यूरोनल संस्कृति सिनैप्टिक कार्यों और दवा स्क्रीनिंग के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है। विशेष रूप से, प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की कम घनत्व वाली संस्कृति व्यक्तिगत न्यूरॉन्स या उपकोशिकीय घटकों के अध्ययन की अनुमति देती है। हमने इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, न्यूरोनल पोलैरिटी, सिनैप्टिक आकृति विज्ञान और कम घनत्व वाले प्राथमिक हिप्पोकैम्पल संस्कृति का उपयोग करके इसके विकासात्मक परिवर्तन द्वारा एक न्यूरॉन के भीतर उपकोशिकीय प्रोटीन स्थानीयकरण दिखाया है। हाल ही में, न्यूरॉन्स के रेडी-टू-यूज़ जमे हुए स्टॉक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं। न्यूरॉन्स के ये जमे हुए स्टॉक पशु प्रयोगों को तैयार करने के लिए आवश्यक समय को कम करते हैं और उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करने में भी योगदान करते हैं। यहां, हम 96-वेल प्लेट का उपयोग करके एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कम घनत्व वाली प्राथमिक संस्कृति विधि पेश करते हैं। हमने चूहे के भ्रूण हिप्पोकैम्पस से न्यूरॉन्स के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जमे हुए स्टॉक का उपयोग किया। न्यूरॉन्स को विशेष समय बिंदुओं पर ग्लियल कोशिकाओं के विकास को कम करके मीडिया परिवर्तन के बिना दीर्घकालिक रूप से सुसंस्कृत किया जा सकता है। कम घनत्व वाली संस्कृति का उपयोग करके यह उच्च-थ्रूपुट परख सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इमेजिंग-आधारित मूल्यांकन की अनुमति देता है।
एक इन विट्रो प्रयोगात्मक प्रणाली का विकास जो सीखने और स्मृति में शामिल सिनैप्टिक कार्यों का आकलन कर सकता है, महत्वपूर्ण है। न्यूरोनल संस्कृति विट्रो में सिनैप्टिक कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है। न्यूरोनल कल्चर तकनीक का पहली बार 1980 के दशक में उपयोग किया गया था, और 1990 के दशक में, प्रोटीन घटकों, प्रोटीन तस्करी, न्यूरोनल ध्रुवीयता, रीढ़ की आकृति विज्ञान, सिनैप्स विकास और प्लास्टिसिटी 4,5,6,7,8 के उपकोशिकीय स्थानीयकरण के संदर्भ में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की कम घनत्व वालीसंस्कृति विकसित की गई थी। . हालांकि, इस तकनीक में कई कदम शामिल हैं: जानवरों का संभोग करना, भ्रूण का विच्छेदन करना, संस्कृति वाहिकाओं को तैयार करना और सप्ताह में एक बार मीडिया परिवर्तन के साथ 3 सप्ताह के लिए कोशिकाओं की खेती करना। इसके अलावा, इसके लिए अग्रिमतकनीकों की आवश्यकता होती है।
हमने चूहे के भ्रूण 9,10 से अलग हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक विकसित किए हैं। न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक उपयोग के लिए तैयार हैं, और कोशिकाओं11,12 की खेती के लिए कोई अग्रिम तकनीक की आवश्यकता नहीं है। दूसरे शब्दों में, जमे हुए स्टॉक से न्यूरॉन्स की खेती एक प्रयोगकर्ता की तकनीक पर निर्भर नहीं करती है। यह पशु प्रयोगों की आवश्यकता को समाप्त करता है (उदाहरण के लिए, पशु प्रयोगों के लिए अनुमति, समयबद्ध गर्भवती जानवरों की व्यवस्था करना, और चूहे के भ्रूण का विच्छेदन), जिससे उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या कम हो जाती है। हाल ही में, न्यूरॉन्स के उच्च गुणवत्ता वाले, उपयोग के लिए तैयार जमे हुए स्टॉक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं। यहां, हमने भ्रूण दिवस (ई) 18 चूहे हिप्पोकैम्पस 13,14,15 से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जमे हुए स्टॉक का उपयोग किया। जमे हुए स्टॉक से न्यूरॉन्स की खेती करने के लिए ग्लिया-वातानुकूलित मीडिया या ग्लियल कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति की आवश्यकता नहीं होती है। अतिरिक्त सीरम के बिना साधारण प्राथमिक संस्कृति मीडिया का उपयोग कोशिकाओं को संस्कृति करने के लिए किया जा सकता है; इसलिए हम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त कर सकते हैं। इसके अलावा, सेल सीडिंग के बाद 3 सप्ताह तक मीडिया विनिमय की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि ग्लियल कोशिकाओं की वृद्धि कम हो जाती है (चित्रा 1)।
डेंड्राइटिक स्पाइन अधिकांश उत्तेजक सिनैप्स के पोस्टसिनेप्टिक कम्पार्टमेंट हैं। उनमें रिसेप्टर प्रोटीन, पोस्टसिनेप्टिक पाड़ प्रोटीन और एक्टिन साइटोस्केलेटल प्रोटीन होते हैं। हमने एक एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन ड्रेब्रिन 5,6,7,16,17,18 पर ध्यान केंद्रित किया। ड्रेब्रिन परिपक्व न्यूरॉन्स 19 में रीढ़ के सिर पर जमा होता है, और हमने सिनैप्टिक अवस्था 15,17,20,21,22,23 के लिए एक मार्कर के रूप में ड्रेब्रिन की सूचना दी। रीडआउट के रूप में ड्रेब्रिन का उपयोग करके एक उच्च-सामग्री विश्लेषण करके, हमने हाल ही में एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टिक एसिड-टाइप ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (एनएमडीएआर) 10 पर फेनसाइक्लिडीन एनालॉग्स के निरोधात्मक प्रभावों और सिनैप्टिक राज्यों15 पर प्राकृतिक यौगिकों और कच्चे दवाओं के एनएमडीएआर-निर्भर प्रभावों की सूचना दी है।
यहां, हम विस्तार से बताते हैं कि कम घनत्व पर न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक को कैसे कल्चर किया जाए। इसके अलावा, हम 96-वेल प्लेटों का उपयोग करके सिनैप्टिक स्थिति का एक ड्रेब्रिन इमेजिंग-आधारित मूल्यांकन दिखाते हैं।
इस विधि में एक महत्वपूर्ण कदम सेल निलंबन को पिघलाना है। बहुत गर्म होने से पहले सेल निलंबन का स्थानांतरण बहुत महत्वपूर्ण है। ऑस्मोलैलिटी के तेजी से परिवर्तन से बचने के लिए, हालांकि, सेल निलंबन को एक बार में माध्यम की एक बड़ी मात्रा में स्थानांतरित न करें। आसमाटिक दबाव में अचानक परिवर्तन से बचने के लिए संस्कृति माध्यम का ड्रॉप-वाइज जोड़ भी महत्वपूर्ण है।
न्यूरॉन्स को अन्य संस्कृति वाहिकाओं में सुसंस्कृत किया जा सकता है: 24-अच्छी प्लेटें, 8-वेल कक्ष, 60 मिमी व्यंजन, या एमईडी जांच। उन मामलों में, हालांकि, अंतिम एकाग्रता और आरा-सी को जोड़ने के समय को समायोजित करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, न्यूरॉन्स के घनत्व को विभिन्न प्रकार के प्रयोगों में अनुकूलित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए उच्च घनत्व वाली संस्कृति की आवश्यकता होती है, और उस स्थिति में, सप्ताह में दो बार मीडिया विनिमय की आवश्यकता होती है (चित्रा 6)। इस प्रकार, कम घनत्व वाली संस्कृति को उच्च घनत्व वाली संस्कृति की तुलना में कम चरणों की आवश्यकता होती है।
कम घनत्व वाली न्यूरोनल संस्कृति को अक्सर अग्रिम तकनीकों की आवश्यकता होती है; हालांकि, रेडी-टू-यूज़ जमे हुए स्टॉक का उपयोग करने से यह समस्या हल हो जाती है। वर्णित विधि एक प्रयोगकर्ता के कौशल पर निर्भर नहीं करती है। जमे हुए स्टॉक की गुणवत्ता स्थिर है और जब तक वे तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत होते हैं और 4 साल तक तापमान परिवर्तन से बचते हैं, तब तक स्थिर रूप से सुसंस्कृत किया जा सकता है।
मध्यम विनिमय के बिना 3 सप्ताह के लिए कोशिकाओं का संवर्धन करना यह सवाल उठाता है कि क्या महत्वपूर्ण ऑस्मोलैलिटी परिवर्तन या संस्कृति मीडिया वाष्पीकरण हैं। हालांकि, हमने पुष्टि की है कि संस्कृति मीडिया वाष्पीकरण छोटा है (3.6% की कमी दर)। सिनैप्टिक प्रोटीन का स्थानीयकरण और न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान 3 सप्ताह के बाद सामान्य दिखाई देते हैं। इसलिए, मीडिया विनिमय के बिना 3 सप्ताह की संस्कृति सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की स्थितियों को प्रभावित करने वाले बड़े ऑस्मोलैलिटी परिवर्तनों का कारण नहीं बनती है। आरा-सी उपचार के बाद प्लेट को इनक्यूबेटर में रखना भी एक महत्वपूर्ण बिंदु है जो वाष्पीकरण को कम करता है।
जमे हुए स्टॉक न्यूरॉन्स के उपयोग के बारे में कोई सीमा नहीं है। हालांकि, कम घनत्व वाली संस्कृति विधि की कुछ सीमाएं हैं। हमने पुष्टि की कि कम घनत्व वाली संस्कृति को न्यूरॉन्स के रूपात्मक अवलोकन, सिनैप्टिक फ़ंक्शन के मूल्यांकन और जीएफपी अभिकर्मक के लिए लागू किया जा सकता है। हालांकि, हमने लाइव सेल इमेजिंग की जांच नहीं की है। इसके अलावा, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी करने के लिए उच्च घनत्व संस्कृति की आवश्यकता होती है।
सिनैप्स परिपक्वता में आमतौर पर 3 सप्ताह7 लगते हैं, और हम यह पुष्टि नहीं कर सकते हैं कि सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में अंत तक उचित सिनैप्स होते हैं। यदि 3 सप्ताह के बाद सिनैप्स परिपक्वता अच्छी नहीं है, तो हमें फिर से संस्कृति करनी होगी। प्रयोगशुरू करने से पहले न्यूरॉन्स की गुणवत्ता जानकर, हम इन 3 हफ्तों को बचा सकते हैं। इसलिए, प्रयोगों को कुशलतापूर्वक करने के लिए, पहले से न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जांच करना सबसे अच्छा है। जमे हुए स्टॉक पहले से न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जांच करना संभव बनाते हैं। जमे हुए स्टॉक का प्रत्येक बैच चूहों के एक कूड़े से उत्पन्न होता है, और हम गुणवत्ता की जांच के लिए प्रत्येक बैच से स्टॉक में से एक का उपयोग कर सकते हैं। ड्रेब्रिन न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जांच के लिए एक अच्छा मार्कर है। जैसा कि वर्णित है, ड्रेब्रिन परिपक्व न्यूरॉन्स में रीढ़ के सिर में जमा होता है, और यह सिनैप्टिक उत्तेजना पर प्रतिक्रिया करता है। इस प्रकार, हम मार्कर के रूप में ड्रेब्रिन का उपयोग करके जमे हुए स्टॉक में न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जांच कर सकते हैं।
इस विधि को सिनैप्टिक अवस्था पर दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है। डेंड्राइटिक स्पाइन से ड्रेब्रिन पलायन सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी22 के प्रारंभिक चरणों के दौरान होता है। इसलिए, दवा उपचार द्वारा प्राप्त ड्रेब्रिन क्लस्टर कमी का पता लगाने से पता चलता है कि दवा सिनैप्स को उत्तेजित करती है और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का कारण बनती है। इसके अलावा, यह पहचानने के लिए कि क्या कमी एनएमडीएआर निर्भर है, 2-एमिनो-5-फॉस्फोनोवेलेरिक एसिड (एपीवी, एक एनएमडीएआर विरोधी) का उपयोग करके एक प्रयोग उपयोगी है। मार्कर के रूप में ड्रेब्रिन का उपयोग करते हुए, यहां तक कि एनएमडीएआर-निर्भरता स्पष्ट रूप से10,15 निर्धारित की जाती है। वर्णित विधि दवा स्क्रीनिंग, सुरक्षा औषधीय अध्ययन और सिनैप्टिक फ़ंक्शन के मूल्यांकन में उपयोगी है।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रयोगों के साथ सहायता के लिए कज़ुमी कामियामा और मनमी कवाडा को धन्यवाद देते हैं। इस कार्य को JSPS KAKENHI (अनुदान संख्या 19K08010 से N.K.) और जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट (AMED) (अनुदान संख्या JP19bk0104077 और JP22bm0804024 को T.S.) द्वारा समर्थित किया गया था।
96 well plate | Zeon Corporation | Gifted | |
96 well plate | greiner | 655986 | |
Anti-drebrin antibody (M2F6) | MBL | D029-3 | Mouse monoclonal (dilution 1:1) |
Anti-MAP2 antibody | Millipore | AB5622 | Rabbit (dilution 1:1000) |
Anti-mouse Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | Dilution 1: 500 |
Anti-rabbit Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | Dilution 1: 500 |
B-27 | Gibco | 17504-044 | 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates |
Borax | Sigma | B-9876 | Final concentration 12 mM |
Boric acid | WAKO | 021-02195 | Final concentration 50 mM |
Bovine serum albumin | Millipore | 12659-100G | Final concentration: 3% in PBS |
Confocal quantitative image cytometer CellVoyager CQ1 |
YOKOGAWA | Phase contrast images | |
Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) | Sigma | C-6645 | Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM) |
DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | Dilution 1:1000 |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates |
In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | Fluorescence images | |
Laminin | Sigma | 114956-81-9 | Final concentration: 20 µg/mL |
Maestro | Axion Biosystems | MEA recordings | |
MEA plate | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Paraformaldehyde | nacalai tesque | 26126-25 | Final concentration: 4% in PBS |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL for normal plates |
Penicillin/Streptomycin | nacalai tesque | 26253-84 | 100 µg/mL for MEA plates |
polyethyleimine | Sigma | 9002-98-6 | Final concentration: 0.1% |
Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL) |
SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 x 106 cells/tube |
Sodium azide | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
SodiumL(+)-Glutamate monohydrate | WAKO | 194-02032 | Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM) |