Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

Summary

De methodologie beschrijft de generatie van van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen (MoDC’s) en hun toepassing voor de in vitro evaluatie van antigene kandidaten tijdens de ontwikkeling van potentiële veterinaire vaccins bij runderen.

Abstract

Dendritische cellen (DC’s) zijn de krachtigste antigeen-presenterende cellen (APC’s) binnen het immuunsysteem. Ze patrouilleren in het organisme op zoek naar ziekteverwekkers en spelen een unieke rol binnen het immuunsysteem door de aangeboren en adaptieve immuunresponsen te koppelen. Deze cellen kunnen fagocytiseren en vervolgens gevangen antigenen presenteren aan effector-immuuncellen, waardoor een breed scala aan immuunresponsen wordt geactiveerd. Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor de in vitro generatie van van runderen monocyten-afgeleide dendritische cellen (MoDC’s) geïsoleerd uit perifere bloedmononucleaire cellen van runderen (PBMC’s) en hun toepassing bij het evalueren van vaccinimmunogeniciteit.

Magnetische celsortering werd gebruikt om CD14⁺ monocyten uit PBMC’s te isoleren, en de suppletie van compleet kweekmedium met interleukine (IL)-4 en granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) werd gebruikt om de differentiatie van CD14⁺ monocyten in naïeve MoDC’s te induceren. De generatie van onrijpe MoDC’s werd bevestigd door het detecteren van de expressie van belangrijke histocompatibiliteitscomplex II (MHC II), CD86 en CD40 celoppervlakmarkers. Een in de handel verkrijgbaar rabiësvaccin werd gebruikt om de onrijpe MoDC’s te pulseren, die vervolgens samen met naïeve lymfocyten werden gekweekt.

De flowcytometrie-analyse van de antigeen-gepulseerde MoDC’s en lymfocytenco-cultuur onthulde de stimulatie van T-lymfocytenproliferatie door de expressie van Ki-67-, CD25-, CD4- en CD8-markers. De analyse van de mRNA-expressie van IFN-γ en Ki-67, met behulp van kwantitatieve PCR, toonde aan dat de MoDC’s de antigeenspecifieke priming van lymfocyten in dit in vitro co-cultuursysteem konden induceren. Bovendien toonde IFN-γ secretie beoordeeld met behulp van ELISA een significant hogere titer (**p < 0,01) in de rabiësvaccin-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur dan in de niet-antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur. Deze resultaten tonen de validiteit van deze in vitro MoDC-test om vaccinimmunogeniciteit te meten, wat betekent dat deze test kan worden gebruikt om potentiële vaccinkandidaten voor runderen te identificeren voordat wordt overgegaan tot in vivo onderzoeken, evenals in vaccinimmunogeniciteitsbeoordelingen van commerciële vaccins.

Introduction

Veterinaire vaccinatie is een cruciaal aspect van de veehouderij en gezondheid, omdat het bijdraagt aan het verbeteren van de voedselzekerheid en het dierenwelzijn door bescherming te bieden tegen ziekten die de veehouderij wereldwijd treffen¹. Een effectieve in vitro methode om de immunogeniciteit van mogelijke vaccinkandidaten te beoordelen, zou het proces van vaccinontwikkeling en -productie helpen versnellen. Het is daarom noodzakelijk om het veld van immuuntesten uit te breiden met innovatieve methodologieën op basis van in vitro studies, omdat dit zou helpen om de complexiteit van de immuunprocessen met betrekking tot immunisatie en pathogene infectie te onthullen. Momenteel worden in vivo immunisatie- en challengestudies bij dieren, die periodieke bemonstering vereisen (bijv. Bloed en milt), gebruikt om de immunogeniciteit van kandidaat-vaccins en adjuvantia te meten. Deze testen zijn duur, tijdrovend en hebben ethische implicaties, omdat in de meeste gevallen euthanasie bij dieren wordt uitgevoerd aan het einde van de proeven.

Als alternatief voor in vivo assays zijn perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) gebruikt om vaccin-geïnduceerde immuunresponsen in vitro^{te evalueren 2}. PBMC’s zijn een heterogene populatie van cellen die bestaat uit 70% -90% lymfocyten, 10% -20% monocyten en een beperkt aantal dendritische cellen (DC’s, 1% -2%)³. PBMC’s herbergen antigeen-presenterende cellen (APC’s) zoals B-cellen, monocyten en DC’s, die voortdurend patrouilleren in het organisme op zoek naar tekenen van infectie of weefselbeschadiging. Lokaal uitgescheiden chemokines vergemakkelijken de rekrutering en activering van APC’s naar deze plaatsen door zich te binden aan celoppervlakreceptoren. In het geval van monocyten richten chemokines hun lot om te differentiëren in DC’s of macrofagen⁴. Zodra DC’s een pathogeen tegenkomen en vangen, migreren ze naar secundaire lymfoïde organen, waar ze de verwerkte pathogene peptide-antigenen kunnen presenteren met behulp van major histocompatibility complex (MHC) klasse I of klasse II oppervlakte-eiwitten aan respectievelijk CD8 + T-cellen of CD4 ⁺ T-cellen, waardoor een immuunrespons ^5,6 wordt geactiveerd.

De sleutelrol die DC’s spelen bij het orkestreren van een beschermende immuunrespons tegen verschillende pathogenen maakt ze een interessant onderzoeksdoel voor het begrijpen van intracellulaire immuunmechanismen, vooral bij het ontwerpen van vaccins en adjuvantia tegen infectieuze agentia⁷. Aangezien de fractie van DC’s die kan worden verkregen uit PBMC’s vrij klein is (1%-2%), zijn monocyten in plaats daarvan gebruikt om DC’s in vitro⁸ te genereren. Deze van monocyten afgeleide DC’s (MoDC’s) werden aanvankelijk ontwikkeld als een mogelijke behandelingsstrategie in kankerimmunotherapie⁹. Meer recent zijn MoDC’s gebruikt voor vaccinonderzoek 10,11,12^, en klassieke monocyten zijn het overheersende subtype (89%) voor MoDC-productie ¹³. De productie van MoDC’s in vitro is eerder bereikt door de toevoeging van granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) gegeven in combinatie met andere cytokines zoals interleukine-4 (IL-4), tumornecrosefactor α (TNF-α) of IL-13^14,15,16.

Het succes van een in vitro MoDC-test is afhankelijk van het vermogen van antigeen-gestimuleerde volwassen MoDC’s om de omvang en het type van de immuunrespons te moduleren die specifiek zijn voor het type antigeen dat is gedetecteerd¹⁷. Het type pathogeen dat door MoDC’s wordt herkend en gepresenteerd, bepaalt de differentiatie van CD4 ⁺ T-helper (Th) -cellen in Th1-, Th2- of Th17-effectorcellen en wordt gekenmerkt door een pathogeenspecifiek secretoir cytokineprofiel. Een Th1-respons wordt opgewekt tegen intracellulaire pathogenen en resulteert in de secretie van interferon-gamma (IFN-γ) en tumornecrosefactor bèta (TNF-β), die fagocytisch-afhankelijke bescherming moduleert. Een Th2-respons wordt geactiveerd tegen parasitaire organismen en wordt gekenmerkt door IL-4, IL-5, IL-10 en IL-13-secretie, die fagocytisch-onafhankelijke humorale bescherming initieert. Th17 biedt neutrofielafhankelijke bescherming tegen extracellulaire bacteriële en schimmelinfecties gemedieerd door de secretie van IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 en TNF-α 18,19,20,21. Op basis van eerdere studies is opgemerkt dat niet alle pathogenen binnen het verwachte cytokineprofiel vallen. Dermale MoDC’s stimuleren bijvoorbeeld, als reactie op leishmania parasitaire infectie, IFN-γ secretie van CD4 + T-cellen en CD8 ⁺ T-cellen, waardoor een beschermende pro-inflammatoire Th1-respons wordt geïnduceerd²².

Het is ook aangetoond dat MoDC’s bij kippen die zijn geprimed met Salmonella lipopolysaccharide (LPS), een variabele respons tegen Salmonella typhimurium kunnen induceren door zowel Th1- als Th2-responsen te activeren, terwijl Salmonella gallinarum alleen een Th2-respons induceert, wat de hogere weerstand van de laatste tegen MoDC-klaring²³ zou kunnen verklaren. De activering van MoDC’s tegen Brucella canis (B. canis) is ook gemeld in zowel honden- als menselijke MoDC’s, wat betekent dat dit een zoönotisch infectiemechanisme kan vertegenwoordigen²⁴. Menselijke MoDC’s geprimed met B. canis induceren een sterke Th1-respons die weerstand biedt tegen ernstige infectie, terwijl Canine MoDC’s een dominante Th17-respons induceren met een verminderde Th1-respons, wat vervolgens leidt tot de oprichting van chronische infectie²⁵. Runder-MoDC’s vertonen een verhoogde affiniteit voor mond- en klauwzeervirus (FMDV) geconjugeerd met immunoglobuline G (IgG) in vergelijking met niet-geconjugeerde FMDV alleen, aangezien de MoDC’s een viraal antilichaamcomplex vormen als reactie op de eerste¹⁰. Samen laten deze studies zien hoe MoDC’s zijn gebruikt om de complexiteit van immuunresponsen tijdens pathogene infectie te analyseren. De adaptieve immuunresponsen kunnen worden geëvalueerd door de kwantificering van specifieke markers geassocieerd met lymfocytenproliferatie. Ki-67, een intracellulair eiwit dat alleen in delende cellen wordt gedetecteerd, wordt beschouwd als een betrouwbare marker voor proliferatiestudies²⁶, en evenzo komt CD25 uitgedrukt op het oppervlak van T-cellen tijdens de late fase van activering overeen met lymfocytenproliferatie^27,28.

Deze studie toont een gestandaardiseerde methode voor de in vitro generatie van runder-MoDC’s, gevolgd door hun toepassing in een in vitro immuuntest die wordt gebruikt voor het testen van de immunogeniciteit van vaccins. Een in de handel verkrijgbaar rabiësvaccin (RV) werd gebruikt om de werkzaamheid van deze test te valideren. T-lymfocytenactivatie en -proliferatie werden gemeten door flowcytometrie, real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) door de analyse van gevestigde celactivatiemarkers zoals Ki-67 en CD25 en de secretie van IFN-γ 28,29,30,31. Er worden geen dier- of menselijke experimentele proeven uitgevoerd tijdens de MoDC-test.

Protocol

Bloedafname wordt uitgevoerd door een gecertificeerde dierenarts in overeenstemming met de ethische richtlijnen van het Oostenrijkse Agentschap voor Gezondheid en Voedselveiligheid (AGES) en in overeenstemming met de geaccepteerde dierenwelzijnsnormen32. De studie kreeg ethische goedkeuring van het Oostenrijkse ministerie van Landbouw. Het experimentele ontwerp voor het genereren van MoDC’s en de daaropvolgende toepassing ervan wordt geïllustreerd in figuur 1. <p…

Representative Results

Deze methodologie beschrijft de in vitro generatie van runder-MoDC’s voor de evaluatie van kandidaat-vaccinantigenen voorafgaand aan het uitvoeren van in vivo studies. Figuur 1 illustreert het experimentele schema van de productie van MoDC’s bij runderen en de toepassing van de MoDC’s voor de in vitro test. Met behulp van de magnetische celsorteertechniek was het mogelijk om ongeveer 26 miljoen CD14+ myocyten te verzamelen uit de geoogste PBMC’s, die eer…

Discussion

Deze studie toont een gestandaardiseerde in vitro methode voor het genereren en fenotyperen van boviene MoDC’s en hun daaropvolgende gebruik bij het meten van de vaccinimmunogeniciteit van een commercieel vaccin (bijv. RV). Runder-MoDC’s kunnen worden gebruikt als een hulpmiddel voor het screenen van potentiële vaccinantigenen tegen veeziekten en het voorspellen van hun potentiële klinische impact op basis van immuunresponsen voordat wordt overgegaan tot in vivo dierproeven. De gegenereerde MoDC’s wer…

Materials

ACK Lysing Buffer	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit	Bio-Rad, UK	PBP015KZZ	Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody	Bio-Rad	MCA2678F	Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA2430PE	Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody	Bio-Rad	MCA1653A647	Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA2431F	Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody	Bio-Rad	MCA837F	Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA2437PE	Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	–	Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube	Falcon Corning	352096 & 352070	15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences	555028	Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol	Sigma Aldrich	1009832500	Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher	10500064	Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS	GE Health care Life Sciences, USA	341691	Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent	Beckman Coulter, Life Sciences	A64669	500 mL
FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA	–	Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube	Falcon Corning	352235	5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran	Sigma Aldrich, Germany	60842-46-8	FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer	Beckman Coulter	–	Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	HSP9601	96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads	Miltenyi Bioteck, Germany	130-050-201	2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza	Beckman Coulter, Germany	–	Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column	Miltenyi Bioteck, Germany	130-042-401	Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody	Bio-Rad	MCA2228F	Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube	Sigma Aldrich	HS4325	1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point	Microsoft	–	The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA928F	Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD86 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD25 monoclonal antibody
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody	Bio-Rad	MCA929F	Isotype control for MHC class II monoclonal antibody
Nobivac Rabies	MSD Animal Health, UK	–	1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals	Bi0-Rad	TCS0803	0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7.4, 1x concentration
Prism – GraphPad 5 Software	Dotmatics	–	Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody	Biolegend, USA	350501	Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody	Biolegend	400101	Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide	BD Bio Sciences	1351101	Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein	R&D System, USA	202-IL-010/CF	Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium	Sigma Aldrich	R8758	Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art	Les Laboratories Servier	–	Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen, Thermo Fisher	18080051	Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24	TPP, Switzerland	92024	24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen, Thermo Fisher	10977023	0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes	Thermo Fisher Scientific	15206067	VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water	Sigma Aldrich	W3500-1L	Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture