소 단핵구 유래 수지상 세포를 이용한 백신 면역원성 측정
Summary
이 방법론은 소 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)의 생성과 소의 잠재적인 동물용 백신 개발 중 항원 후보의 시험관 내 평가를 위한 적용을 설명합니다.
Abstract
수지상 세포(DC)는 면역 체계 내에서 가장 강력한 항원 제시 세포(APC)입니다. 그들은 병원체를 찾기 위해 유기체를 순찰하고 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 연결하여 면역 체계 내에서 독특한 역할을 합니다. 이 세포는 식세포화한 다음 포획된 항원을 이펙터 면역 세포에 제시하여 다양한 범위의 면역 반응을 유발할 수 있습니다. 이 논문은 소 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 분리된 소 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)의 시험관 내 생성을 위한 표준화된 방법과 백신 면역원성 평가에 대한 적용을 보여줍니다.
자기 기반 세포 분류를 사용하여 PBMC에서 CD14+ 단핵구를 분리하고, 완전한 배양 배지에 인터루킨(IL)-4를 보충하고 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 사용하여 CD14+ 단핵구가 나이브 MoDC로 분화되도록 유도했습니다. 미성숙 MoDC의 생성은 주요 조직적합성 복합체 II(MHC II), CD86 및 CD40 세포 표면 마커의 발현을 검출하여 확인되었습니다. 상업적으로 이용 가능한 광견병 백신을 사용하여 미성숙 MoDC를 펄싱했으며, 이후 나이브 림프구와 공동 배양되었습니다.
항원 펄스 MoDC와 림프구 공동 배양의 유세포 분석은 Ki-67, CD25, CD4 및 CD8 마커의 발현을 통한 T 림프구 증식의 자극을 밝혀냈습니다. 정량적 PCR을 사용하여 IFN-γ 및 Ki-67의 mRNA 발현을 분석한 결과, MoDC가 이 시험관 내 공동 배양 시스템에서 림프구의 항원 특이적 프라이밍을 유도할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, ELISA를 사용하여 평가된 IFN-γ 분비는 비항원 펄스 MoDC-림프구 공동 배양보다 광견병 백신 펄스 MoDC-림프구 공동 배양에서 유의하게 더 높은 역가(**p < 0.01)를 보였다. 이러한 결과는 백신 면역원성을 측정하기 위한 이 시험관 내 MoDC 분석의 타당성을 보여주며, 이는 이 분석이 생체 내 시험을 진행하기 전에 소에 대한 잠재적인 백신 후보를 식별하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 상용 백신의 백신 면역원성 평가에서도 사용될 수 있음을 의미합니다.
Introduction
수의학 예방 접종은 전 세계적으로 가축 부문에 영향을 미치는 질병에 대한 보호를 제공함으로써 식량 안보와 동물 복지 개선에 기여하기 때문에 축산 및 건강의 중요한 측면을 나타냅니다1. 가능한 백신 후보의 면역원성을 평가하는 효과적인 시험관 내 방법은 백신 개발 및 생산 과정을 가속화하는 데 도움이 될 것입니다. 따라서 시험관 내 연구를 기반으로 한 혁신적인 방법론으로 면역 분석 분야를 확장하는 것이 필요하며, 이는 예방 접종 및 병원체 감염과 관련된 면역 과정의 복잡성을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 현재, 주기적인 샘플링(예: 혈액 및 비장)이 필요한 생체 내 동물 면역화 및 챌린지 연구는 후보 백신 및 보조제의 면역원성을 측정하는 데 사용됩니다. 이러한 분석은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 윤리적 의미가 있는데, 대부분의 경우 동물 안락사는 시험이 끝날 때까지 수행되기 때문입니다.
생체 내 분석의 대안으로 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 시험관 내백신 유도 면역 반응을 평가했습니다 2. PBMC는 70%-90% 림프구, 10%-20% 단핵구 및 제한된 수의 수지상 세포(DC, 1%-2%)로 구성된 이질적인 세포 집단입니다3. PBMC에는 B 세포, 단핵구 및 DC와 같은 항원 제시 세포(APC)가 있어 감염이나 조직 손상의 징후를 찾기 위해 유기체를 지속적으로 순찰합니다. 국소 분비된 케모카인은 세포 표면 수용체에 결합하여 이러한 부위에 대한 APC의 모집 및 활성화를 촉진합니다. 단핵구의 경우, 케모카인은 DC 또는 대식세포로 분화하도록 운명을 지시한다4. DC는 병원체를 만나 포획하자마자 이차 림프 기관으로 이동하여 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II 표면 단백질을 사용하여 처리된 병원체 펩타이드 항원을 각각 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포에 제시하여 면역 반응을 유발할 수 있습니다 5,6.
다양한 병원체에 대한 보호 면역 반응을 조율하는 데 있어 DC가 수행하는 핵심 역할은 특히 감염원에 대한 백신 및 보조제를 설계할 때 세포 내 면역 메커니즘을 이해하기 위한 흥미로운 연구 대상이 됩니다7. PBMC로부터 얻을 수 있는 DC의 비율이 다소 작기 때문에(1%-2%), 대신 단핵구가 시험관 내에서 DC를 생성하는 데 사용되었습니다 8. 이러한 단핵구 유래 DC(MoDC)는 암 면역요법에서 가능한 치료 전략으로 처음 개발되었다9. 최근에는 MoDC가 백신 연구에 사용되었으며(10,11,12), 고전적 단핵구(monocyte)가 MoDC 생산의 주요 아형(89%)이다 13. 시험관 내에서 MoDC의 생산은 이전에 인터루킨-4(IL-4), 종양 괴사 인자 α(TNF-α) 또는 IL-13과 같은 다른 사이토카인과 함께 제공되는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 첨가를 통해 달성되었습니다 14,15,16.
in vitro MoDC 분석의 성공 여부는 항원 자극 성숙 MoDC가 검출된 항원 유형에 특이적인 면역 반응의 범위와 유형을 조절하는 능력에 달려 있다17. MoDC에 의해 인식되고 제시되는 병원체의 유형은 CD4+ T 헬퍼(Th) 세포를 Th1, Th2 또는 Th17 이펙터 세포로 분화하는 것을 결정하며 병원체 특이적 분비 사이토카인 프로파일을 특징으로 합니다. Th1 반응은 세포 내 병원체에 대해 유도되어 식세포 의존성 보호를 조절하는 인터페론-감마(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 베타(TNF-β)의 분비를 초래합니다. Th2 반응은 기생 유기체에 대해 유발되며 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13 분비를 특징으로 하며, 이는 식세포 독립적인 체액 보호를 시작합니다. Th17은 IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 및 TNF-α 18,19,20,21의 분비에 의해 매개되는 세포외 박테리아 및 진균 감염에 대한 호중구 의존성 보호를 제공한다. 이전 연구에 따르면 모든 병원체가 예상되는 사이토카인 프로필에 속하는 것은 아닙니다. 예를 들어, 리슈만편모충 기생충 감염에 대한 반응으로 피부 MoDC는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 IFN-γ 분비를 자극하여 보호 전염증 Th1 반응을 유도한다22.
또한 살모넬라 지질다당류(LPS)로 프라이밍된 닭 MoDC에서 Th1 및 Th2 반응을 모두 활성화하여 살모넬라 티피뮤리움에 대한 가변 반응을 유도할 수 있는 반면, 살모넬라 갈리나룸은 Th2 반응만 유도하여 MoDC 클리어런스23에 대한 후자의 더 높은 내성을 설명할 수 있습니다. 브루셀라 캐니스(Brucella canis, B. canis)에 대한 MoDC의 활성화는 개와 인간 MoDC 모두에서 보고되었으며, 이는 이것이 인수공통전염병 감염 메커니즘을 나타낼 수 있음을 의미한다24. B. canis로 프라이밍된 인간 MoDC는 중증 감염에 대한 내성을 부여하는 강력한 Th1 반응을 유도하는 반면, 개 MoDC는 감소된 Th1 반응으로 지배적인 Th17 반응을 유도하여 만성 감염을 확립합니다25. 소 MoDC는 비접합 FMDV 단독에 비해 면역글로불린 G(IgG)와 결합된 구제역 바이러스(FMDV)에 대해 향상된 친화력을 보여주며, 이는 MoDC가 전자에 반응하여 바이러스-항체 복합체를 형성하기 때문입니다10. 종합하면, 이러한 연구는 병원체 감염 중 면역 반응의 복잡성을 분석하기 위해 MoDC가 어떻게 사용되었는지 보여줍니다. 적응 면역 반응은 림프구 증식과 관련된 특정 마커의 정량화에 의해 평가될 수 있다. 분열하는 세포에서만 검출되는 세포내 단백질인 Ki-67은 증식 연구의 신뢰할 수 있는 마커로 간주되며26, 유사하게, 활성화의 후기 단계 동안 T 세포 표면에서 발현되는 CD25는 림프구 증식에 해당합니다27,28.
이 연구는 백신의 면역원성을 테스트하는 데 사용되는 체외 면역 분석에 적용한 후 소 MoDC의 시험관 내 생성을 위한 표준화된 방법을 보여줍니다. 이 분석의 효능을 검증하기 위해 상업적으로 이용 가능한 광견병 백신(RV)을 사용했습니다. T 림프구 활성화 및 증식은 Ki-67 및 CD25와 같은 잘 확립된 세포 활성화 마커의 분석과 IFN-γ 28,29,30,31의 분비를 통해 유세포 분석, 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정되었습니다. MoDC 분석 중에는 동물 또는 인간 실험 시험이 수행되지 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 소 MoDC를 생성 및 표현형화하기 위한 표준화된 시험관 내 방법과 상업용 백신(예: RV)의 백신 면역원성을 측정하는 데 사용하는 방법을 보여줍니다. 소 MoDC는 가축 질병에 대한 잠재적인 백신 항원을 스크리닝하고 생체 내 동물 시험을 진행하기 전에 면역 반응을 기반으로 잠재적인 임상 영향을 예측하기 위한 도구로 사용할 수 있습니다. 생성된 MoDC는 형태학적, 표현형적, ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
동물의 건강 상태를 확인하고 BTV를 제공하는 데 도움을 준 Eveline Wodak 박사와 Angelika Loistch 박사(AGES), 소의 혈액을 제공한 Bernhard Reinelt 박사, Real-Time PCR 실험 및 언어 편집에 대한 유용한 조언을 제공한 IAEA의 Bharani Settypalli 박사와 William Dundon 박사에게 각각 감사드립니다.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco, Thermo Fisher | A1049201 | Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction |
| BD Vacutainer Heparin Tubes | Becton, Dickinson (BD) and Company | 366480 | 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size |
| Bovine Dendritic Cell Growth Kit | Bio-Rad, UK | PBP015KZZ | Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF |
| Bovine IFN-γ ELISA Kit | Bio-Rad | MCA5638KZZ | Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant |
| CD14 Antibody | Bio-Rad | MCA2678F | Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1 |
| CD25 Antibody | Bio-Rad | MCA2430PE | Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1 |
| CD4 Antibody | Bio-Rad | MCA1653A647 | Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a |
| CD40 Antibody | Bio-Rad | MCA2431F | Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1 |
| CD8 Antibody | Bio-Rad | MCA837F | Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a |
| CD86 Antibody | Bio-Rad | MCA2437PE | Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1 |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | – | Thermal cycler PCR machine |
| Corning Centrifuge Tube | Falcon Corning | 352096 & 352070 | 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube |
| Cytofix/Cytoperm Plus | BD Bio Sciences | 555028 | Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 1009832500 | Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher | 10500064 | Qualified, heat inactivated |
| Ficoll Plaque PLUS | GE Health care Life Sciences, USA | 341691 | Lymphocyte-isolation medium |
| FlowClean Cleaning Agent | Beckman Coulter, Life Sciences | A64669 | 500 mL |
| FlowJo | FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA | – | Flow cytometer Histogram software |
| FlowTubes/ FACS (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube | Falcon Corning | 352235 | 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis |
| Fluoresceinisothiocynat-Dextran | Sigma Aldrich, Germany | 60842-46-8 | FITC-dextran MW |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | – | Flow cytometer machine |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | HSP9601 | 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear |
| Human CD14 MicroBeads | Miltenyi Bioteck, Germany | 130-050-201 | 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs |
| Kaluza | Beckman Coulter, Germany | – | Flow cytometer multicolor data analysis software |
| MACS Column | Miltenyi Bioteck, Germany | 130-042-401 | Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens |
| MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody | Bio-Rad | MCA2228F | Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine |
| Microcentrifuge Tube | Sigma Aldrich | HS4325 | 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube |
| Microsoft Power Point | Microsoft | – | The graphical illustrations of experimental design |
| Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody | Bio-Rad | MCA928F | Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody |
| Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody | Bio-Rad | MCA928PE | Isotype control CD86 monoclonal antibody |
| Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody | Bio-Rad | MCA928PE | Isotype control CD25 monoclonal antibody |
| Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody | Bio-Rad | MCA929F | Isotype control for MHC class II monoclonal antibody |
| Nobivac Rabies | MSD Animal Health, UK | – | 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain |
| Optical seals | Bi0-Rad | TCS0803 | 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, Thermo Fisher | 15140122 | 100 mL |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco, Thermo Fisher | 10010023 | pH 7.4, 1x concentration |
| Prism – GraphPad 5 Software | Dotmatics | – | Statistical software |
| Purified Anti-human Ki-67 antibody | Biolegend, USA | 350501 | Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67 |
| Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400101 | Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody |
| READIDROP Propidium Iodide | BD Bio Sciences | 1351101 | Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D System, USA | 202-IL-010/CF | Interleukin-2, 20 ng/ml |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor. |
| RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R8758 | Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate |
| SMART-servier medical art | Les Laboratories Servier | – | Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5270 | 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes. |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen, Thermo Fisher | 18080051 | Kit for cDNA synthsis |
| Tissue Culture Test plate 24 | TPP, Switzerland | 92024 | 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL |
| Trypan Blue Solution | Gibco, Thermo Fisher | 15250061 | 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen, Thermo Fisher | 10977023 | 0.1 µm membrane filtered distilled water |
| VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes | Thermo Fisher Scientific | 15206067 | VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample. |
| Water | Sigma Aldrich | W3500-1L | Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture |
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