Bestämning av vaccinimmunogenicitet med hjälp av dendritiska celler härledda från nötkreatur

Summary

Metoden beskriver genereringen av dendritiska celler som härrör från bovina monocyter (MoDC) och deras tillämpning för in vitro-utvärdering av antigena kandidater under utvecklingen av potentiella veterinärvacciner hos nötkreatur.

Abstract

Dendritiska celler (DC) är de mest potenta antigenpresenterande cellerna (APC) i immunsystemet. De patrullerar organismen och letar efter patogener och spelar en unik roll inom immunsystemet genom att länka de medfödda och adaptiva immunsvaren. Dessa celler kan fagocytera och sedan presentera fångade antigener till effektorimmunceller, vilket utlöser ett brett spektrum av immunsvar. Denna artikel demonstrerar en standardiserad metod för in vitro-generering av bovint monocyt-härledda dendritiska celler (MoDCs) isolerade från perifera mononukleära celler från nötkreatur (PBMC) och deras tillämpning vid utvärdering av vaccinimmunogenicitet.

Magnetbaserad cellsortering användes för att isolera CD14 + -monocyter från PBMC, och tillskott av komplett odlingsmedium med interleukin (IL) -4 och granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) användes för att inducera differentieringen av CD14 ⁺ -monocyter till naiva MoDC. Genereringen av omogna MoDCs bekräftades genom detektering av uttrycket av stora histokompatibilitetskomplex II (MHC II), CD86 och CD40 cellytmarkörer. Ett kommersiellt tillgängligt rabiesvaccin användes för att pulsa de omogna MoDC, som därefter samodlades med naiva lymfocyter.

Flödescytometrianalysen av antigenpulsade MoDCs och lymfocytsamodling avslöjade stimulering av T-lymfocytproliferation genom uttryck av Ki-67-, CD25-, CD4- och CD8-markörer. Analysen av mRNA-uttrycket av IFN-γ och Ki-67, med kvantitativ PCR, visade att MoDCs kunde inducera antigenspecifik priming av lymfocyter i detta in vitro-samodlingssystem . Dessutom visade IFN-γ-sekretion bedömd med ELISA en signifikant högre titer (**p < 0,01) i den rabiesvaccinpulsade MoDC-lymfocytsamkulturen än i den icke-antigenpulsade MoDC-lymfocytsamkulturen. Dessa resultat visar validiteten av denna in vitro MoDC-analys för att mäta vaccinimmunogenicitet, vilket innebär att denna analys kan användas för att identifiera potentiella vaccinkandidater för nötkreatur innan man fortsätter med in vivo-studier , liksom i vaccinimmunogenicitetsbedömningar av kommersiella vacciner.

Introduction

Veterinärvaccinering är en viktig aspekt av djurhållning och hälsa, eftersom den bidrar till att förbättra livsmedelstryggheten och djurskyddet genom att ge skydd mot sjukdomar som påverkar djurhållningssektorn globalt¹. En effektiv in vitro-metod för att bedöma immunogeniciteten hos möjliga vaccinkandidater skulle bidra till att påskynda processen för utveckling och produktion av vaccin. Det är därför nödvändigt att utöka området immunanalyser med innovativa metoder baserade på in vitro-studier , eftersom detta skulle bidra till att avslöja komplexiteten i immunprocesserna relaterade till immunisering och patogeninfektion. För närvarande används in vivo-immuniserings – och provokationsstudier på djur, som kräver periodisk provtagning (t.ex. blod och mjälte), för att mäta immunogeniciteten hos kandidatvacciner och adjuvanser. Dessa analyser är dyra, tidskrävande och har etiska konsekvenser, eftersom i de flesta fall utförs avlivning av djur i slutet av försöken.

Som ett alternativ till in vivo-analyser har mononukleära celler i perifert blod (PBMC) använts för att utvärdera vaccininducerade immunsvar in vitro². PBMC är en heterogen population av celler som består av 70% -90% lymfocyter, 10% -20% monocyter och ett begränsat antal dendritiska celler (DCs, 1% -2%)³. PBMCs har antigenpresenterande celler (APC) såsom B-celler, monocyter och DC, som ständigt patrullerar organismen som söker efter tecken på infektion eller vävnadsskada. Lokalt utsöndrade kemokiner underlättar rekrytering och aktivering av APC till dessa platser genom att binda till cellytereceptorer. När det gäller monocyter styr kemokiner sitt öde att antingen differentiera till DC eller makrofager⁴. Så snart DCs stöter på och fångar en patogen migrerar de till sekundära lymfoida organ, där de kan presentera de bearbetade patogenpeptidantigenerna med användning av MHC (Major Histocompatibility Complex) klass I eller klass II ytproteiner till CD8 + T-celler respektive CD4 ⁺ T-celler, vilket utlöser ett immunsvar ^5,6.

Den nyckelroll som DCs spelar för att orkestrera ett skyddande immunsvar mot olika patogener gör dem till ett intressant forskningsmål för att förstå intracellulära immunmekanismer, särskilt vid utformning av vacciner och adjuvans mot smittämnen⁷. Eftersom andelen DCs som kan erhållas från PBMCs är ganska liten (1% -2%), har monocyter istället använts för att generera DCs in vitro 8. Dessa monocyt-härledda DCs (MoDCs) utvecklades initialt som en möjlig behandlingsstrategi vid cancerimmunterapi⁹. På senare tid har MoDC använts för vaccinforskning 10,11,12^, och klassiska monocyter är den dominerande subtypen (89%) för MoDC-produktion ¹³. Produktionen av MoDCs in vitro har tidigare uppnåtts genom tillägg av granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) som ges i kombination med andra cytokiner såsom interleukin-4 (IL-4), tumörnekrosfaktor α (TNF-α) eller IL-13^14,15,16.

Framgången för en in vitro MoDC-analys beror på förmågan hos antigenstimulerade mogna MoDCs att modulera omfattningen och typen av immunsvaret specifikt för den typ av antigen som detekteras¹⁷. Den typ av patogen som känns igen och presenteras av MoDCs bestämmer differentieringen av CD4 ⁺ T-hjälparceller (Th) i antingen Th1-, Th2- eller Th17-effektorceller och kännetecknas av en patogenspecifik sekretorisk cytokinprofil. Ett Th1-svar framkallas mot intracellulära patogener och resulterar i utsöndring av interferon-gamma (IFN-γ) och tumörnekrosfaktor beta (TNF-β), vilket modulerar fagocytberoende skydd. Ett Th2-svar utlöses mot parasitiska organismer och kännetecknas av IL-4, IL-5, IL-10 och IL-13-utsöndring, vilket initierar fagocytoberoende humoralt skydd. Th17 erbjuder neutrofilberoende skydd mot extracellulära bakterie- och svampinfektioner medierade av utsöndringen av IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 och TNF-α 18,19,20,21. Baserat på tidigare studier har det noterats att inte alla patogener faller inom den förväntade cytokinprofilen. Till exempel stimulerar dermala MoDCs, som svar på Leishmania parasitisk infektion, IFN-γ-utsöndring från CD4 + T-celler och CD8 ⁺ T-celler, vilket inducerar ett skyddande proinflammatoriskt Th1-svar²².

Det har också visats att i kyckling MoDCs primad med Salmonellalipopolysackarid (LPS), kan inducera ett variabelt svar mot Salmonella typhimurium genom att aktivera både Th1- och Th2-svar, medan Salmonella gallinarum inducerar ett Th2-svar ensamt, vilket kan förklara den högre resistensen hos den senare mot MoDC-clearance²³. Aktivering av MoDCs mot Brucella canis (B. canis) har också rapporterats i både hund och humana MoDCs, vilket innebär att detta kan representera en zoonotisk infektionsmekanism²⁴. Humana MoDCs grundade med B. canis inducerar ett starkt Th1-svar som ger resistens mot allvarlig infektion, medan hundens MoDCs inducerar ett dominerande Th17-svar med ett reducerat Th1-svar, vilket leder till etablering av kronisk infektion²⁵. Bovint MoDC uppvisar en ökad affinitet för mul- och klövsjukevirus (FMDV) konjugerat med immunglobulin G (IgG) jämfört med icke-konjugerat FMDV ensamt, eftersom MoDC bildar ett virus-antikroppskomplex som svar på de tidigare¹⁰. Sammantaget visar dessa studier hur MoDCs har använts för att analysera komplexiteten hos immunsvar under patogeninfektion. Det adaptiva immunsvaret kan utvärderas genom kvantifiering av specifika markörer associerade med lymfocytproliferation. Ki-67, ett intracellulärt protein som endast detekteras i delande celler, betraktas som en tillförlitlig markör för proliferationsstudier²⁶, och på samma sätt motsvarar CD25 uttryckt på ytan av T-celler under den sena aktiveringsfasen lymfocytproliferation^27,28.

Denna studie visar en standardiserad metod för di vitro-generering av MoDCs hos nötkreatur följt av deras tillämpning i en in vitro-immunanalys som används för att testa immunogeniciteten hos vacciner. Ett kommersiellt tillgängligt rabiesvaccin (RV) användes för att validera effekten av denna analys. T-lymfocytaktivering och proliferation mättes med flödescytometri, kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (qPCR) och enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) genom analys av väletablerade cellaktiveringsmarkörer såsom Ki-67 och CD25 och utsöndringen av IFN-γ 28,29,30,31. Inga djur- eller humanförsök utförs under MoDC-analysen.

Protocol

Blodinsamling utförs av en certifierad veterinärtjänst i enlighet med de etiska riktlinjerna från den österrikiska myndigheten för hälsa och livsmedelssäkerhet (AGES) och i enlighet med de godkända djurskyddsnormerna32. Studien fick etiskt godkännande från det österrikiska jordbruksministeriet. Den experimentella designen för MoDCs generering och dess efterföljande tillämpning illustreras i figur 1. 1. Produktion av nai…

Representative Results

Denna metod beskriver in vitro-generering av MoDC för nötkreatur för utvärdering av vaccinkandidatantigener innan in vivo-studier utförs. Figur 1 illustrerar försöksschemat för generering av MoDC från nötkreatur och tillämpningen av MoDC för in vitro-testet. Med hjälp av den magnetbaserade cellsorteringstekniken var det möjligt att samla in cirka 26 miljoner CD14 + myocyter från de skördade PBMC: erna, som tidigare isolerades från 50 ml …

Discussion

Denna studie visar en standardiserad in vitro-metod för att generera och fenotypa bovina MoDCs och deras efterföljande användning vid mätning av vaccinimmunogeniciteten hos ett kommersiellt vaccin (t.ex. RV). Bovina MoDCs kan användas som ett verktyg för screening av potentiella vaccinantigener mot nötkreatursjukdomar och förutsäga deras potentiella kliniska inverkan baserat på immunsvar innan man går vidare mot in vivo-djurförsök . De genererade MoDC identifierades baserat på deras morfol…

Materials

ACK Lysing Buffer	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit	Bio-Rad, UK	PBP015KZZ	Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody	Bio-Rad	MCA2678F	Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA2430PE	Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody	Bio-Rad	MCA1653A647	Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA2431F	Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody	Bio-Rad	MCA837F	Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA2437PE	Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	–	Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube	Falcon Corning	352096 & 352070	15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences	555028	Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol	Sigma Aldrich	1009832500	Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher	10500064	Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS	GE Health care Life Sciences, USA	341691	Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent	Beckman Coulter, Life Sciences	A64669	500 mL
FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA	–	Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube	Falcon Corning	352235	5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran	Sigma Aldrich, Germany	60842-46-8	FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer	Beckman Coulter	–	Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	HSP9601	96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads	Miltenyi Bioteck, Germany	130-050-201	2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza	Beckman Coulter, Germany	–	Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column	Miltenyi Bioteck, Germany	130-042-401	Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody	Bio-Rad	MCA2228F	Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube	Sigma Aldrich	HS4325	1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point	Microsoft	–	The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA928F	Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD86 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD25 monoclonal antibody
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody	Bio-Rad	MCA929F	Isotype control for MHC class II monoclonal antibody
Nobivac Rabies	MSD Animal Health, UK	–	1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals	Bi0-Rad	TCS0803	0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7.4, 1x concentration
Prism – GraphPad 5 Software	Dotmatics	–	Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody	Biolegend, USA	350501	Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody	Biolegend	400101	Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide	BD Bio Sciences	1351101	Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein	R&D System, USA	202-IL-010/CF	Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium	Sigma Aldrich	R8758	Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art	Les Laboratories Servier	–	Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen, Thermo Fisher	18080051	Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24	TPP, Switzerland	92024	24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen, Thermo Fisher	10977023	0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes	Thermo Fisher Scientific	15206067	VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water	Sigma Aldrich	W3500-1L	Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture