Generering och odling av höggradig serös äggstockscancer patient-derived organoider
Summary
Patient-derived organoids (PDO) är en tredimensionell (3D) kultur som kan efterlikna tumörmiljön in vitro. Vid höggradig serös äggstockscancer utgör SUB en modell för att studera nya biomarkörer och terapier.
Abstract
Organoider är 3D-dynamiska tumörmodeller som kan odlas framgångsrikt från patient-härledd äggstockstumörvävnad, ascites eller pleuravätska och hjälper till vid upptäckten av nya terapier och prediktiva biomarkörer för äggstockscancer. Dessa modeller rekapitulerar klonal heterogenitet, tumörmikromiljön och cell-cell- och cell-matrisinteraktioner. Dessutom har de visat sig matcha den primära tumören morfologiskt, cytologiskt, immunhistokemiskt och genetiskt. Således underlättar organoider forskning om tumörceller och tumörmikromiljön och är överlägsna cellinjer. Det nuvarande protokollet beskriver distinkta metoder för att generera patient-härledda äggstockscancerorganoider från patienttumörer, ascites och pleuravätskeprover med en högre än 97% framgångsgrad. Patientproverna separeras i cellulära suspensioner genom både mekanisk och enzymatisk nedbrytning. Cellerna pläteras sedan med hjälp av ett basalmembranextrakt (BME) och stöds med optimerade tillväxtmedier som innehåller kosttillskott som är specifika för odling av höggradig serös äggstockscancer (HGSOC). Efter att ha bildat initiala organoider kan SUB: erna upprätthålla långsiktig kultur, inklusive passaging för expansion för efterföljande experiment.
Introduction
År 2021 diagnostiserades cirka 21 410 kvinnor i USA nyligen med epitelial äggstockscancer och 12 940 kvinnor dog av denna sjukdom1. Även om tillräckliga framsteg har gjorts inom kirurgi och kemoterapi, utvecklar över 70% av patienterna med avancerad sjukdom kemoterapeutisk resistens och dör inom 5 år efter diagnos 2,3. Därför behövs nya strategier för att behandla denna dödliga sjukdom och representativa, tillförlitliga modeller för preklinisk forskning.
Cancercellinjer och patient-derived xenografts (PDX) skapade från primära äggstockstumörer är de viktigaste instrumenten som används i äggstockscancerforskning. En stor fördel med cancercellinjer är deras snabba expansion. Men deras kontinuerliga kultur resulterar i fenotypiska och genotypiska förändringar som får cancercellinjerna att avvika från det ursprungliga primära cancertumörprovet. På grund av de befintliga skillnaderna mellan cancercellinjen och den primära tumören misslyckas läkemedelsanalyser som har positiva effekter i cellinjer att ha samma effekter i kliniska prövningar2. För att övervinna dessa begränsningar används PDX-modeller. Dessa modeller skapas genom att implantera färsk äggstockscancervävnad i immunbristfälliga möss. Eftersom de är in vivo-modeller liknar de mer exakt mänskliga biologiska egenskaper och är i sin tur mer prediktiva för läkemedelsutfall. Dessa modeller har dock också betydande begränsningar, inklusive kostnad, tid och resurser som krävs för att generera dem4.
SUBs erbjuder en alternativ modell för preklinisk forskning som övervinner begränsningarna hos både cancercellinjer och PDX-modeller. SUBs rekapitulerar en patients tumör och tumörmikromiljö och ger därmed en in vitro-dragbar modell idealisk för preklinisk forskning 2,3,5. Dessa 3D-modeller har självorganiseringsförmåga som modellerar den primära tumören, vilket är en egenskap som deras tvådimensionella (2D) cellinjemotsvarigheter inte har. Vidare har dessa modeller visat sig genetiskt och funktionellt representera sina modertumörer och är därmed tillförlitliga modeller för att studera nya terapier och biologiska processer. Kort sagt, de erbjuder långsiktig expansion och lagringskapacitet som liknar cellinjer men omfattar också mikromiljön och cell-cellinteraktioner som är inneboende i musmodeller 4,6.
Det nuvarande protokollet beskriver skapandet av SUB från patient-härledda tumörer, ascites och pleuravätskeprover med en högre än 97% framgångsgrad. SUB-kulturerna kan sedan utvidgas i flera generationer och användas för att testa läkemedelsterapikänslighet och prediktiva biomarkörer. Denna metod representerar en teknik som kan användas för att anpassa behandlingar baserat på de terapeutiska svaren hos SUB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Äggstockscancer är extremt dödlig på grund av dess avancerade stadium vid diagnos, liksom den vanliga utvecklingen av kemoterapiresistens. Många framsteg inom äggstockscancerforskning har gjorts genom att använda cancercellinjer och PDX-modeller; Det finns dock ett uppenbart behov av en mer representativ och överkomlig in vitro-modell . SUBs har visat sig exakt representera tumörheterogeniteten, tumörmikromiljön och de genomiska och transkriptomiska egenskaperna hos deras primära tumörer och är dä…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för vägledningen från Ron Bose, MD, PhD, och hjälpen från Barbara Blachut, MD, vid upprättandet av detta protokoll. Vi vill också erkänna Washington University’s School of Medicine i St. Louis’s Department of Obstetrics and Gynecology och Division of Gynecologic Oncology, Washington University’s Dean’s Scholar Program och Reproductive Scientist Development Program för deras stöd till detta projekt.
Materials
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
Riferimenti
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581 (2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
