בידוד וטיהור תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ומקרו-וסקולריים מדגימות שמקורן בריאה
Summary
למרות שהוא מאתגר, הבידוד של תאי אנדותל ריאתיים חיוני למחקרים על דלקת ריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך לבידוד בעל תפוקה גבוהה וטוהר גבוה של תאי אנדותל מקרו-וסקולריים ומיקרו-וסקולריים.
Abstract
זמינותם של תאים שבודדו מרקמות ואיברים בריאים וחולים מהווה מרכיב מפתח בגישות של רפואה מותאמת אישית. למרות שביובנקים יכולים לספק אוסף רחב של תאים ראשוניים ואימורטליים למחקר ביו-רפואי, אלה אינם מכסים את כל צרכי הניסוי, במיוחד אלה הקשורים למחלות או גנוטיפים ספציפיים. תאי אנדותל וסקולריים (ECs) הם מרכיבים מרכזיים של התגובה הדלקתית החיסונית, ולכן ממלאים תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מגוון הפרעות. יש לציין כי ECs מאתרים שונים מציגים תכונות ביוכימיות ותפקודיות שונות, מה שהופך את הזמינות של סוגי EC ספציפיים (כלומר, כלי דם, כלי דם, עורקים וורידים) חיונית לתכנון ניסויים אמינים. כאן, הליכים פשוטים להשגת תפוקה גבוהה, כמעט טהור אנושי תאי אנדותל microvascular מן העורק הריאה ואת parenchyma הריאות מתוארים בפירוט. מתודולוגיה זו ניתנת לשכפול בקלות בעלות נמוכה יחסית על ידי כל מעבדה כדי להשיג עצמאות ממקורות מסחריים ולקבל פנוטיפים / גנוטיפים EC שעדיין אינם זמינים.
Introduction
אנדותל כלי הדם מצפה את פני השטח הפנימיים של כלי הדם. הוא ממלא תפקידי מפתח בוויסות קרישת הדם, טונוס כלי הדם ותגובות דלקתיות של מערכת החיסון 1,2,3,4. למרות שתרבית תאי אנדותל (ECs) שבודדו מדגימות אנושיות חיונית למטרות מחקר, יש לציין כי ECs מכלי דם שונים (עורקים, ורידים, נימים) יש פונקציות ספציפיות. אלה אינם ניתנים לשחזור מלא על ידי תאי אנדותל ורידים טבוריים אנושיים (HUVEC), אשר זמינים בקלות ונמצאים בשימוש נרחב במחקרים על פתופיזיולוגיה של אנדותל כלי דם 5,6. לדוגמה, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של הריאה האנושית (HLMVECs) ממלאים תפקידי מפתח בדלקת ריאות על ידי שליטה בגיוס והצטברות לויקוציטים 4,7. לפיכך, הגדרה ניסיונית שמטרתה לשחזר דלקת ריאות עם נאמנות גבוהה צריך לכלול HLMVECs. מצד שני, תפקוד לקוי של EC ניתן לראות במספר פתולוגיות; לכן, ECs מן המטופל הם היסוד לבניית מודל אמין במבחנה של המחלה. לדוגמה, הבידוד של שברי ECs מעורק הריאה (HPAECs), שנותחו מהריאות המושתלות של אנשים שנפגעו מסיסטיק פיברוזיס (CF), איפשר לנו לחשוף מנגנונים של תפקוד לקוי של האנדותל במחלה זו 8,9.
לפיכך, פרוטוקולים שמטרתם לייעל את הבידוד של ECs ממקורות / איברים שונים גם במצבי מחלה חיוניים כדי לספק לחוקרים כלי מחקר יקרי ערך, במיוחד כאשר כלים אלה אינם זמינים מסחרית. פרוטוקולי בידוד HLMVEC ו-HPAEC דווחו בעבר 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. בכל המקרים, העיכול האנזימטי של דגימות הריאה הביא לאוכלוסיות תאים מעורבות, שטוהרו באמצעות מדיה סלקטיבית אד-הוק ומיון תאים מבוססי חרוזים מגנטיים או ציטומטריים. אופטימיזציות נוספות של פרוטוקולים אלה חייבות לטפל בשתי בעיות עיקריות בבידוד EC: (1) זיהום תאים ורקמות, שיש לפתור במעברי התרבית המוקדמים ביותר האפשריים כדי למזער את ההזדקנות המשוכפלת של EC20; ו-(2) התשואה הנמוכה של מבודדי EC ראשוניים.
מחקר זה מתאר פרוטוקול חדש לבידוד בעל תפוקה גבוהה וטוהר גבוה של HLMVECs ו-HPAECs. הליך זה יכול להיות ישים בקלות ולתת ECs macrovascular ו microvascular טהור בכמה צעדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
התפקידים המרובים שממלאים תאי אנדותל וסקולריים בפתופיזיולוגיה האנושית הופכים תאים אלה לכלי חיוני למחקרים פתוגנטיים ופרמקולוגיים במבחנה . מכיוון שECs מאתרים / איברים שונים של כלי דם מציגים תכונות ותפקודים מוזרים, הזמינות של ECs בריאים וחולים מהאיבר המעניין תהיה אידיאלית למטרות מחקר. לד?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממשרד האוניברסיטה והמחקר האיטלקי (לשעבר 60% 2021 ו -2022) ל- R. P. ועל ידי מענקים מקרן סיסטיק פיברוזיס האיטלקית (FFC #23/2014) וממשרד הבריאות האיטלקי (L548/93) ל- M. R.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
Riferimenti
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
