肺由来サンプルからの微小血管および大血管内皮細胞の単離および精製(英語)
Summary
挑戦的ですが、肺内皮細胞の単離は肺炎症の研究に不可欠です。本プロトコルは、大血管内皮細胞および微小血管内皮細胞の高収率、高純度単離のための手順を記載する。
Abstract
健康な組織や病気の組織や臓器から分離された細胞の入手可能性は、個別化医療アプローチの重要な要素を表しています。バイオバンクは、生物医学研究のために初代細胞と不死化細胞の幅広いコレクションを提供できますが、これらはすべての実験ニーズ、特に特定の疾患や遺伝子型に関連するニーズをカバーするわけではありません。血管内皮細胞(EC)は免疫炎症反応の重要な構成要素であり、したがって、さまざまな障害の病因において中心的な役割を果たします。特に、異なる部位のECは異なる生化学的および機能的特性を示すため、信頼性の高い実験を設計するには、特定のECタイプ(すなわち、大血管、微小血管、動脈、および静脈)の利用可能性が不可欠です。ここでは、肺動脈および肺実質から高収率で事実上純粋なヒト大血管および微小血管内皮細胞を得るための簡単な手順が詳細に示されている。この方法論は、商業的供給源からの独立性を達成し、まだ利用できないEC表現型/遺伝子型を得るために、どの研究室でも比較的低コストで容易に再現することができる。
Introduction
血管内皮は血管の内面を裏打ちします。血液凝固、血管緊張、および免疫炎症反応の調節に重要な役割を果たします1,2,3,4。ヒト検体から分離した内皮細胞(EC)の培養は研究目的に不可欠ですが、異なる血管(動脈、静脈、毛細血管)からのECには特定の機能があることに留意する必要があります。これらは、血管内皮の病態生理学の研究で容易に入手でき、広く使用されているヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)では完全に再現できません5,6。たとえば、ヒト肺微小血管内皮細胞(HLMVEC)は、白血球の動員と蓄積を制御することにより、肺の炎症に重要な役割を果たします4,7。したがって、肺の炎症を忠実度の高い状態で再現することを目的とした実験設定には、HLMVECを含める必要があります。一方、EC機能障害はいくつかの病状で観察できます。したがって、患者からのECは、疾患の信頼性の高いin vitroモデルを構築するための基本です。たとえば、嚢胞性線維症(CF)に冒された人々の外植肺から解剖された肺動脈(HPAEC)からのECの断片の分離により、この病気の内皮機能障害のメカニズムを明らかにすることができました8,9。
したがって、疾患状態にあるさまざまなソース/臓器からのECの分離を最適化することを目的としたプロトコルは、特にこれらのツールが市販されていない場合に、研究者に貴重な研究ツールを提供するために不可欠です。HLMVECおよびHPAEC単離プロトコルは、以前に報告されている10、11、12、13、14、15、16、17、18、19。すべての場合において、肺検体の酵素消化により混合細胞集団が得られ、アドホック選択培地および磁気ビーズまたはサイトメトリーベースの細胞選別を使用して精製されました。これらのプロトコルのさらなる最適化は、EC分離における2つの主要な問題に対処する必要があります:(1)細胞および組織の汚染、EC複製老化を最小限に抑えるために可能な限り早い培養継代で解決する必要があります20;(2)一次EC分離株の収率が低い。
この研究では、HLMVECおよびHPAECの高収率、高純度単離のための新しいプロトコルについて説明します。この手順は簡単に適用でき、数ステップで実質的に純粋な大血管および微小血管ECが得られます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒトの病態生理学において血管内皮細胞が果たす複数の役割により、これらの細胞は in vitro の病態学的および薬理学的研究に不可欠なツールとなっています。異なる血管部位/臓器由来のECは独特の特徴と機能を示すため、目的の臓器からの健康なECと疾患のECの利用可能性は、研究目的にとって理想的です。たとえば、HLMVECは肺の炎症に関する研究に不可欠です。したがって、これら?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、イタリア大学研究省(ex60%2021および2022)からR.P.への資金提供と、イタリア嚢胞性線維症財団(FFC#23/2014)およびイタリア保健省(L548/93)からM.R.への助成金によって支援されました。
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
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