Aislamiento y purificación de células endoteliales microvasculares y macrovasculares a partir de muestras derivadas de pulmón
Summary
Aunque es un desafío, el aislamiento de las células endoteliales pulmonares es esencial para los estudios sobre la inflamación pulmonar. El presente protocolo describe un procedimiento para el aislamiento de alto rendimiento y alta pureza de células endoteliales macrovasculares y microvasculares.
Abstract
La disponibilidad de células aisladas de tejidos y órganos sanos y enfermos representa un elemento clave para los enfoques de medicina personalizada. Aunque los biobancos pueden proporcionar una amplia colección de células primarias e inmortalizadas para la investigación biomédica, estos no cubren todas las necesidades experimentales, particularmente las relacionadas con enfermedades o genotipos específicos. Las células endoteliales vasculares (CE) son componentes clave de la reacción inflamatoria inmune y, por lo tanto, desempeñan un papel central en la patogénesis de una variedad de trastornos. En particular, las CE de diferentes sitios muestran diferentes propiedades bioquímicas y funcionales, lo que hace que la disponibilidad de tipos específicos de EC (es decir, macrovascular, microvascular, arterial y venosa) sea esencial para diseñar experimentos confiables. Aquí, se ilustran en detalle procedimientos simples para obtener células endoteliales macrovasculares y microvasculares humanas de alto rendimiento, prácticamente puras, a partir de la arteria pulmonar y el parénquima pulmonar. Esta metodología puede ser fácilmente reproducida a un costo relativamente bajo por cualquier laboratorio para lograr la independencia de las fuentes comerciales y obtener fenotipos/genotipos EC que aún no están disponibles.
Introduction
El endotelio vascular recubre la superficie interna de los vasos sanguíneos. Desempeña un papel clave en la regulación de la coagulación sanguínea, el tono vascular y las respuestas inmunoinflamatorias 1,2,3,4. Aunque el cultivo de células endoteliales (CE) aisladas de especímenes humanos es esencial para fines de investigación, debe señalarse que las CE de diferentes vasos sanguíneos (arterias, venas, capilares) tienen funciones específicas. Estos no pueden ser completamente recapitulados por las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), que son fácilmente disponibles y ampliamente utilizadas en estudios sobre fisiopatología del endotelio vascular 5,6. Por ejemplo, las células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HLMVEC) desempeñan un papel clave en la inflamación pulmonar al controlar el reclutamiento y la acumulación de leucocitos 4,7. Por lo tanto, un entorno experimental dirigido a reproducir la inflamación pulmonar con alta fidelidad debe incluir HLMVEC. Por otro lado, la disfunción EC se puede observar en varias patologías; por lo tanto, las CE del paciente son fundamentales para construir un modelo in vitro confiable de la enfermedad. Por ejemplo, el aislamiento de fragmentos de CE de la arteria pulmonar (HPAECs), diseccionados de los pulmones explantados de personas afectadas por fibrosis quística (FQ), nos ha permitido descubrir mecanismos de disfunción endotelial en esta enfermedad 8,9.
Por lo tanto, los protocolos destinados a optimizar el aislamiento de CE de diferentes fuentes / órganos también en estados de enfermedad son esenciales para proporcionar a los investigadores herramientas de investigación valiosas, particularmente cuando estas herramientas no están disponibles comercialmente. Los protocolos de aislamiento HLMVEC y HPAEC han sido reportados previamente 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. En todos los casos, la digestión enzimática de las muestras pulmonares dio lugar a poblaciones de células mixtas, que se purificaron utilizando medios selectivos ad hoc y perlas magnéticas o clasificación celular basada en citometría. Las optimizaciones adicionales de estos protocolos deben abordar dos problemas principales en el aislamiento de CE: (1) contaminación celular y tisular, que debe resolverse lo antes posible en los pasajes de cultivo para minimizar la senescencia replicativa EC20; y 2) el bajo rendimiento de las cepas primarias de CE.
Este estudio describe un nuevo protocolo para el aislamiento de alto rendimiento y alta pureza de HLMVEC y HPAEC. Este procedimiento puede ser fácilmente aplicable y proporcionar CE macrovasculares y microvasculares prácticamente puras en unos pocos pasos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las múltiples funciones desempeñadas por las células endoteliales vasculares en la fisiopatología humana hacen de estas células una herramienta indispensable para los estudios patogénicos y farmacológicos in vitro . Dado que las CE de diferentes sitios vasculares / órganos muestran características y funciones peculiares, la disponibilidad de CE sanas y enfermas del órgano de interés sería ideal para fines de investigación. Por ejemplo, los HLMVEC son esenciales para los estudios sobre la inflamació…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos del Ministerio italiano de Universidad e Investigación (ex 60% 2021 y 2022) a R. P. y por subvenciones de la Fundación Italiana de Fibrosis Quística (FFC # 23 / 2014) y del Ministerio de Salud italiano (L548/93) a M. R.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
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