Hasta kaynaklı meme organoidlerinin kurulması ve kültürü
Summary
Burada, hasta kaynaklı meme tümörü rezeksiyonlarından veya normal meme dokusundan insan meme organoidlerinin oluşturulması için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Protokol, insan hasta kaynaklı meme organoidlerinin kültürlenmesi, dondurulması ve çözülmesi için kapsamlı adım adım talimatlar sağlar.
Abstract
Meme kanseri, birkaç farklı histolojik ve moleküler alt tipte sınıflandırılmış kompleks bir hastalıktır. Laboratuvarımızda geliştirilen hasta kaynaklı meme tümörü organoidleri, çoklu tümör kaynaklı hücre popülasyonlarının bir karışımından oluşur ve bu nedenle tümör hücresi çeşitliliği ve ortamının yerleşik 2D kanser hücre hatlarından daha iyi bir yaklaşımını temsil eder. Organoidler, hücre-hücre etkileşimlerinde ve kanser ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı bilinen hücre-hücre dışı matriks etkileşimlerine izin veren ideal bir in vitro model olarak hizmet eder. Hasta kaynaklı organoidler, insan kökenli oldukları için fare modellerine göre de avantajlara sahiptir. Ayrıca, hasta tümörlerinin genomik, transkriptomik ve metabolik heterojenitesini özetledikleri gösterilmiştir; Böylece, tümör karmaşıklığını ve hasta çeşitliliğini temsil edebilirler. Sonuç olarak, hedef keşif ve doğrulama ve ilaç duyarlılığı testleri hakkında daha doğru bilgiler sağlamaya hazırdırlar. Bu protokolde, hasta kaynaklı meme organoidlerinin rezeke edilmiş meme tümörlerinden (kanser organoidleri) veya redüktif mamoplasti kaynaklı meme dokusundan (normal organoidler) nasıl oluştuğuna dair ayrıntılı bir gösterim sunuyoruz. Bunu, 3D organoid kültürün, genişlemenin, paslaşmanın, dondurmanın ve hasta kaynaklı meme organoid kültürlerinin çözülmesinin kapsamlı bir açıklaması izler.
Introduction
Meme kanseri (BC), kadınlarda en sık görülen malignitedir ve 2022’de Amerika Birleşik Devletleri’nde teşhis edileceği tahmin edilen 287.850 yeni vaka ile1. Yıllık taramalar, hedefe yönelik tedaviler ve genetik yatkınlığın daha iyi anlaşılması ile erken teşhisteki son gelişmelere rağmen, Amerika Birleşik Devletleri’ndeki kadınlarda kanser ölümlerinin ikinci önde gelen nedeni olma eğilimindedir ve yılda 40.000 > meme kanserine atfedilmektedir1. Meme kanseri günümüzde primer tümörün histopatolojik ve moleküler değerlendirmesine göre birçok alt tipe ayrılmaktadır. Daha iyi alt tip tabakalaşması, alt tipe özgü tedavi seçenekleri ile hasta sonuçlarını iyileştirmiştir2. Örneğin, HER2’nin bir proto-onkogen3 olarak tanımlanması, Trastuzumab’ın gelişmesine yol açmıştır, bu da bu oldukça agresif alt tipin çoğu hastada yönetilebilir olmasını sağlamıştır4. Bu karmaşık hastalığın genetiği ve transkriptomikleri üzerine hastaya özgü bir şekilde daha fazla araştırma, hastaya özgü kişiselleştirilmiş tedavi rejimlerinin daha iyi geliştirilmesine ve tahmin edilmesine yardımcı olacaktır 2,5. Hasta kaynaklı organoidler (PDO’lar), moleküler düzeyde kanser hakkında bilgi edinmek, yeni hedefler veya biyobelirteçler belirlemek ve yeni tedavi stratejileri tasarlamak için umut verici yeni bir modeldir 6,7,8.
PDO’lar, taze rezeke edilmiş primer doku örneklerinden türetilen çok hücreli, üç boyutlu (3D) yapılardır 8,9. Tipik olarak hücre dışı matris (ECM) proteinlerinin bir kombinasyonundan oluşan bir hidrojel matrisine gömülerek üç boyutlu olarak yetiştirilirler ve bu nedenle tümör hücresi-ECM etkileşimlerini incelemek için kullanılabilirler. PDO’lar hasta çeşitliliğini temsil eder ve tümörün hücresel heterojenitesini ve genetik özelliklerini özetler10,11,12. İn vitro modeller olarak, genetik manipülasyona ve yüksek verimli ilaç ekranlarına izin verirler13,14,15. Ayrıca, PDO’lar hastanın ilaç duyarlılığını ve tedavi stratejilerini kliniğe paralel olarak değerlendirmek ve hasta sonuçlarını tahmin etmeye yardımcı olmak için makul bir şekilde kullanılabilir16,17,18. Kemoterapinin yanı sıra, kemoradyasyona bireysel hasta yanıtlarını incelemek için bazı organoid modeller de kullanılmıştır19,20. PDO’ların araştırma ve klinik kullanım için umut verici uygulanabilirliği göz önüne alındığında, Ulusal Kanser Enstitüsü, bu tümör kaynaklı yeni kanser modellerini üretmek ve sağlamak için İnsan Kanser Modelleri Girişimi (HCMI)21 adlı uluslararası bir konsorsiyum başlattı. HCMI aracılığıyla geliştirilen çeşitli kanser türlerinin organoid modellerinin çoğu, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) 22 aracılığıyla temin edilebilir.
Normal meme organoidlerinin, meme bezinde bulunan farklı epitel hücre popülasyonlarından oluştuğu gösterilmiştir 11,23 ve bu nedenle temel biyolojik süreçleri incelemek, tümörigeneze neden olan sürücü mutasyonlarını analiz etmek ve kanser kökenli hücre soy çalışmaları için harika modeller olarak hizmet eder 6,15 . Meme tümörü organoid modelleri, özellikle dirençli tümörler için yeni tedaviler geliştirme umutlarını teşvik eden yeni hedefleri belirlemek için kullanılmıştır24,25,26. Guillen ve ark., tedaviye dirençli meme tümörlerinin hasta kaynaklı ksenograft (PDX) ve eşleşen PDX kaynaklı organoid (PDxO) modellerini kullanarak, organoidlerin hassas tıp için güçlü modeller olduğunu ve ilaç yanıtlarını değerlendirmek ve doğrudan tedavi kararlarını paralel olarak değerlendirmek için kullanılabilecek güçlü modeller olduğunu göstermiştir28. Ayrıca, çeşitli bağışıklık hücreleri27,28,29, fibroblastlar30,31 ve mikroplar 32,33 ile PDO’ların kültürlenmesi için yeni ko-kültür yöntemlerinin geliştirilmesi, tümör mikroçevresinin kanser ilerlemesi üzerindeki etkisini incelemek için bir fırsat sunmaktadır. Pankreas veya kolorektal tümörlerden türetilen PDO’lar için bu tür birçok ko-kültür yöntemi aktif olarak kurulurken, meme PDO’ları için benzer yerleşik ko-kültür yöntemleri sadece doğal öldürücü hücreler34 ve fibroblastlar35 için bildirilmiştir.
Farklı meme kanseri alt tiplerini temsil eden >100 hasta kaynaklı organoidin ilk biyobankası, Hans Clevers grubu36,37 tarafından geliştirilmiştir. Bu çabanın bir parçası olarak, Clevers grubu şu anda yaygın olarak kullanılan meme organoid büyümesi için ilk karmaşık kültür ortamını geliştirdi36. Bir takip çalışması, meme PDO’larının ve hasta kaynaklı organoid ksenogreftlerin (PDOX’lar) kuruluşu ve kültürü hakkında kapsamlı bir açıklama sağlamıştır38. Welm laboratuvarı, fetal sığır serumu (FBS) ve daha az büyüme faktörü içeren nispeten daha basit bir büyüme ortamında kültürlenen geniş bir BC PDX modelleri ve PDxOs koleksiyonu geliştirdi39,40. Bağımsız olarak çok çeşitli naif hasta kaynaklı meme kanseri organoid modelleri 11’i geliştirdik ve karakterize ettik ve HCMI girişimi21’in bir parçası olarak BC PDO modellerinin geliştirilmesine katıldık. Burada, hasta kaynaklı meme organoid model sistemleri oluşturmada kullandığımız metodolojiyi detaylandıran pratik bir rehber sunmayı amaçlıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Laboratuvarımız, naif tümör rezeksiyonlarından veya kazımalarından organoidler oluşturmak için yukarıdaki protokolleri başarıyla kullanmıştır. Bu protokolü , redüktif mamoplastilerle elde edilen meme dokusundan veya kanser hastalarının bitişik veya distal normal meme dokusundan normal organoidler geliştirmek için de kullandık. Rezeke edilen primer tümörlerin yaklaşık %30-40’ı başarılı uzun dönem (>pasaj 8) tümör organoid kültürleri ile sonuçlanmıştır. Birkaç pasajdan sonr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma boyunca kritik tartışmalar için Spector laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Norman Sachs ve Hans Clevers’e (Hubrecht Enstitüsü, Hollanda) başlangıçta bize organoid kültürleme protokollerini sağladıkları için teşekkür ederiz. CSHL Kanser Merkezi Histoloji ve Mikroskopi Paylaşılan Kaynaklarını hizmetleri ve teknik uzmanlığı için kabul ediyoruz (NCI 2P3OCA45508). Histolojik numune hazırlama konusundaki yardımları için Dr. Qing Gao’ya teşekkür ederiz. Dr. Karen Kostroff’un (Northwell Health) hasta tümör örnekleri sağlama konusundaki desteği için minnettarız. Northwell Health Biobanking ekibinin örnek alma çabalarını da takdir ediyoruz ve hastalara ve ailelerine araştırma için doku bağışında bulundukları için teşekkür ediyoruz. Bu araştırma CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) ve Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson ve D.L.S.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
- di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
- Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
- Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
- Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. &. #. 1. 9. 3. ;., Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
- Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Ricerca sul cancro. , (2022).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
- Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
- Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- . HCMI Catalog Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022)
- . Search ATCC Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022)
- Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
- Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
- Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
- Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- . HUB Organoids: Patient in the lab Available from: https://www.huborganoids.nl (2022)
- Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
- Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
- . PDX Portal Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022)
- Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
- Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
- Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
- Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).
