Ett detaljerat protokoll tillhandahålls här för att etablera humana bröstorganoider från patient-härledda brösttumörresektioner eller normal bröstvävnad. Protokollet ger omfattande steg-för-steg-instruktioner för odling, frysning och upptining av mänskliga patient-härledda bröstorganoider.
Bröstcancer är en komplex sjukdom som har klassificerats i flera olika histologiska och molekylära subtyper. Patient-derived brösttumörorganoider utvecklade i vårt laboratorium består av en blandning av flera tumör-härledda cellpopulationer, och representerar därmed en bättre approximation av tumörcelldiversitet och miljö än de etablerade 2D-cancer cellinjer. Organoider fungerar som en idealisk in vitro-modell , vilket möjliggör cell-extracellulära matrisinteraktioner, kända för att spela en viktig roll i cell-cellinteraktioner och cancerprogression. Patient-derived organoider har också fördelar jämfört med musmodeller eftersom de är av mänskligt ursprung. Vidare har de visat sig rekapitulera den genomiska, transkriptomiska såväl som metaboliska heterogeniteten hos patienttumörer; Således kan de representera tumörkomplexitet såväl som patientdiversitet. Som ett resultat är de redo att ge mer exakta insikter i målupptäckt och validering och läkemedelskänslighetsanalyser. I detta protokoll ger vi en detaljerad demonstration av hur patient-härledda bröstorganoider etableras från resekterade brösttumörer (cancerorganoider) eller reduktiv mammoplastik-härledd bröstvävnad (normala organoider). Detta följs av en omfattande redogörelse för 3D-organoidkultur, expansion, passaging, frysning samt upptining av patient-härledda bröstorganoidkulturer.
Bröstcancer (BC) är den vanligaste maligniteten hos kvinnor, med 287 850 nya fall som beräknas diagnostiseras i USA 20221. Trots de senaste framstegen inom tidig upptäckt med årliga screenings, riktade terapier och en bättre förståelse för genetisk predisposition, råder det att vara den näst ledande orsaken till cancerdöd hos kvinnor i USA, med > 40 000 dödsfall som tillskrivs bröstcancer årligen1. Bröstcancer klassificeras för närvarande i flera subtyper baserat på histopatologisk och molekylär utvärdering av den primära tumören. Bättre subtypstratifiering har förbättrat patientresultaten med subtypspecifika behandlingsalternativ2. Till exempel har identifieringen av HER2 som en proto-onkogen3 lett till utvecklingen av Trastuzumab, vilket har gjort denna mycket aggressiva subtyp hanterbar hos de flesta patienter4. Ytterligare forskning om genetik och transkriptomik av denna komplexa sjukdom på ett patientspecifikt sätt kommer att hjälpa till att utveckla och förutsäga bättre patientspecifika personliga behandlingsregimer 2,5. Patient-derived organoids (PDO) är en lovande ny modell för att få insikter om cancer på molekylär nivå, identifiera nya mål eller biomarkörer och utforma nya behandlingsstrategier 6,7,8.
SUB är flercelliga, tredimensionella (3D) strukturer som härrör från nyligen resekterade primära vävnadsprover 8,9. De odlas tredimensionellt genom att vara inbäddade i en hydrogelmatris, vanligtvis sammansatt av en kombination av extracellulära matrixproteiner (ECM), och kan därför användas för att studera tumörcell-ECM-interaktioner. SUBs representerar patientdiversitet och rekapitulerar cellulär heterogenitet och genetiska egenskaper hos tumören10,11,12. Eftersom de är in vitro-modeller möjliggör de genetisk manipulation och läkemedelsskärmar med hög kapacitet13,14,15. Vidare kan PDOs rimligen användas för att utvärdera patientens läkemedelskänslighet och behandlingsstrategier parallellt med kliniken och hjälpa till att förutsäga patientresultat16,17,18. Förutom kemoterapi har vissa organoidmodeller också använts för att undersöka enskilda patienters svar på kemostrålning19,20. Med tanke på den lovande tillämpligheten av SUBs för forskning och klinisk användning har National Cancer Institute initierat ett internationellt konsortium, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, för att generera och tillhandahålla dessa tumörhärledda nya cancermodeller. Många av de organoidmodeller av olika cancertyper som utvecklats genom HCMI är tillgängliga via American Type Culture Collection (ATCC)22.
Normala bröstorganoider har visat sig bestå av olika epitelcellpopulationer närvarande i bröstkörteln 11,23 och fungerar därmed som bra modeller för att studera grundläggande biologiska processer, för att analysera drivarmutationer som orsakar tumörgenes och för cancercell-of-origin härstamningsstudier 6,15 . Brösttumörorganoidmodeller har använts för att identifiera nya mål som uppmuntrar utsikterna att utveckla nya terapier, särskilt för resistenta tumörer24,25,26. Med hjälp av patient-derived xenograft (PDX) och matchade PDX-härledda organoidmodeller (PDxO) av behandlingsresistenta brösttumörer visade Guillen et al. att organoider är kraftfulla modeller för precisionsmedicin, som kan utnyttjas för att utvärdera läkemedelssvar och direkta terapibeslut parallellt28. Vidare ger utvecklingen av nya samodlingsmetoder för odling av SUB med olika immunceller27,28,29, fibroblaster 30,31 och mikrober 32,33 en möjlighet att studera tumörmikromiljöns inverkan på cancerprogression. Medan många sådana samodlingsmetoder aktivt etableras för SUB härrörande från bukspottskörtel- eller kolorektala tumörer, har liknande etablerade samodlingsmetoder för bröst-PDO endast rapporterats för naturliga mördarceller34 och fibroblaster35.
Den första biobanken med >100 patientbaserade organoider som representerar olika bröstcancersubtyper utvecklades av Hans Clevers grupp36,37. Som en del av detta arbete utvecklade Clevers-gruppen också det första komplexa odlingsmediet för bröstorganoidtillväxt, som för närvarande används allmänt36. En uppföljningsstudie gav en omfattande redogörelse för etablering och odling av SUB:er i bröst och patienthärledda organoida xenotransplantat (PDOX)38. Welm-labbet utvecklade en stor samling BC PDX-modeller och PDxOs som odlas i ett jämförelsevis enklare tillväxtmedium innehållande fetalt bovint serum (FBS) och färre tillväxtfaktorer39,40. Vi har självständigt utvecklat och karakteriserat ett stort antal naiva patient-härledda bröstcancerorganoidmodeller11, och deltagit i utvecklingen av BC PDO-modeller som en del av HCMI-initiativet21. Här strävar vi efter att ge en praktisk guide som beskriver den metod som används av oss för att generera patient-härledda bröstorganoidmodellsystem.
Vårt laboratorium har framgångsrikt använt ovanstående protokoll för att etablera organoider från naiva tumörresektioner eller skrapningar. Vi har också använt detta protokoll för att utveckla normala organoider från bröstvävnad erhållen via reduktiva mammoplastier eller från cancerpatienters intilliggande eller distala normala bröstvävnad. Cirka 30% -40% av de resekterade primära tumörerna resulterade i framgångsrika långsiktiga (>passage 8) tumörorganoidkulturer. Tumörorganoidlinjerna so…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka medlemmarna i Spectors labb för kritiska diskussioner under arbetets gång. Vi tackar Norman Sachs och Hans Clevers (Hubrecht Institute, Nederländerna) för att de inledningsvis försåg oss med sitt organoidodlingsprotokoll. Vi erkänner CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources för tjänster och teknisk expertis (NCI 2P3OCA45508). Vi tackar Dr. Qing Gao för hjälp med histologisk provberedning. Vi är tacksamma för stödet från Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) för att tillhandahålla patienttumörprover. Vi uppskattar också Northwell Health Biobanks-teamets ansträngningar för provförvärv, och vi tackar patienterna och deras familjer för att donera vävnader för forskning. Denna forskning stöddes av CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) och Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson och D.L.S).
15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
37 °C bead bath | |||
37 °C CO2 incubator | |||
50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
Parafilm | transparent film | ||
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |