Établissement et culture d’organoïdes mammaires dérivés de patientes
Summary
Un protocole détaillé est fourni ici pour établir des organoïdes mammaires humains à partir de résections de tumeurs mammaires dérivées de patientes ou de tissu mammaire normal. Le protocole fournit des instructions complètes étape par étape pour la culture, la congélation et la décongélation d’organoïdes mammaires humains dérivés de patientes.
Abstract
Le cancer du sein est une maladie complexe qui a été classée en plusieurs sous-types histologiques et moléculaires différents. Les organoïdes tumoraux mammaires dérivés de patients développés dans notre laboratoire consistent en un mélange de plusieurs populations cellulaires dérivées de tumeurs et représentent donc une meilleure approximation de la diversité et du milieu des cellules tumorales que les lignées cellulaires cancéreuses 2D établies. Les organoïdes servent de modèle in vitro idéal, permettant des interactions de matrice cellule-extracellulaire, connues pour jouer un rôle important dans les interactions cellule-cellule et la progression du cancer. Les organoïdes dérivés de patients présentent également des avantages par rapport aux modèles murins car ils sont d’origine humaine. En outre, il a été démontré qu’ils récapitulent l’hétérogénéité génomique, transcriptomique et métabolique des tumeurs des patients; Ainsi, ils sont capables de représenter la complexité tumorale ainsi que la diversité des patients. En conséquence, ils sont prêts à fournir des informations plus précises sur la découverte et la validation des cibles et les tests de sensibilité aux médicaments. Dans ce protocole, nous fournissons une démonstration détaillée de la façon dont les organoïdes mammaires dérivés de patients sont établis à partir de tumeurs mammaires réséquées (organoïdes cancéreux) ou de tissus mammaires dérivés de mammoplasties réductrices (organoïdes normaux). Ceci est suivi d’un compte rendu complet de la culture organoïde 3D, de l’expansion, du passage, de la congélation, ainsi que de la décongélation de cultures organoïdes mammaires dérivées de patientes.
Introduction
Le cancer du sein (BC) est la tumeur maligne la plus fréquente chez les femmes, avec 287 850 nouveaux cas estimés diagnostiqués aux États-Unis en 20221. Malgré les progrès récents de la détection précoce avec des dépistages annuels, des thérapies ciblées et une meilleure compréhension de la prédisposition génétique, il prévaut être la deuxième cause de décès par cancer chez les femmes aux États-Unis, avec > 40 000 décès attribués au cancer du sein chaque année1. Le cancer du sein est actuellement classé en plusieurs sous-types basés sur l’évaluation histopathologique et moléculaire de la tumeur primaire. Une meilleure stratification des sous-types a amélioré les résultats pour les patients grâce à des options de traitement spécifiques au sous-type2. Par exemple, l’identification de HER2 en tant que proto-oncogène3 a conduit au développement du trastuzumab, ce qui a rendu ce sous-type très agressif gérable chez la plupart des patients4. D’autres recherches sur la génétique et la transcriptomique de cette maladie complexe d’une manière spécifique au patient aideront à développer et à prédire de meilleurs schémas thérapeutiques personnalisés spécifiques au patient 2,5. Les organoïdes dérivés de patients (AOP) sont un nouveau modèle prometteur pour mieux comprendre le cancer au niveau moléculaire, identifier de nouvelles cibles ou biomarqueurs et concevoir de nouvelles stratégies de traitement 6,7,8.
Les AOP sont des structures multicellulaires tridimensionnelles (3D) dérivées d’échantillons de tissus primaires fraîchement réséqués 8,9. Ils sont cultivés en trois dimensions en étant incorporés dans une matrice d’hydrogel, généralement composée d’une combinaison de protéines de la matrice extracellulaire (ECM), et peuvent donc être utilisés pour étudier les interactions cellule-ECM tumorale. Les AOP représentent la diversité des patients et récapitulent l’hétérogénéité cellulaire et les caractéristiques génétiques de la tumeur10,11,12. Étant des modèles in vitro, ils permettent la manipulation génétique et les criblages de médicaments à haut débit13,14,15. De plus, les AOP peuvent être utilisées de manière plausible pour évaluer la sensibilité des patients aux médicaments et les stratégies de traitement parallèlement à la clinique et aider à prédire les résultats pour les patients16,17,18. Outre la chimiothérapie, certains modèles organoïdes ont également été utilisés pour examiner les réponses individuelles des patients à la chimioradiothérapie19,20. Compte tenu de l’applicabilité prometteuse des AOP pour la recherche et l’utilisation clinique, le National Cancer Institute a lancé un consortium international, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, pour générer et fournir ces nouveaux modèles de cancer dérivés de tumeurs. Bon nombre des modèles organoïdes de divers types de cancer développés par l’intermédiaire de l’ICMH sont disponibles via l’American Type Culture Collection (ATCC)22.
Il a été démontré que les organoïdes mammaires normaux sont composés de différentes populations de cellules épithéliales présentes dans la glande mammaire 11,23 et servent donc d’excellents modèles pour étudier les processus biologiques de base, pour analyser les mutations conductrices causant la tumorigenèse et pour les études de lignée cancéreuse 6,15 . Des modèles organoïdes de tumeurs mammaires ont été utilisés pour identifier de nouvelles cibles qui ouvrent des perspectives encourageantes pour le développement de nouvelles thérapies, en particulier pour les tumeurs résistantes24,25,26. En utilisant des xénogreffes dérivées de patients (PDX) et des modèles organoïdes dérivés de PDX appariés (PDxO) de tumeurs mammaires résistantes au traitement, Guillen et al. ont montré que les organoïdes sont des modèles puissants pour la médecine de précision, qui peuvent être exploités pour évaluer les réponses aux médicaments et diriger les décisions thérapeutiques en parallèle28. De plus, le développement de nouvelles méthodes de co-culture pour la culture d’AOP avec diverses cellules immunitaires27,28,29, fibroblastes 30,31 et microbes 32,33 présente une opportunité d’étudier l’impact du microenvironnement tumoral sur la progression du cancer. Alors que de nombreuses méthodes de co-culture de ce type sont activement établies pour les AOP dérivées de tumeurs pancréatiques ou colorectales, des méthodes de co-culture similaires établies pour les AOP mammaires n’ont été signalées que pour les cellules tueuses naturelles34 et les fibroblastes35.
La première biobanque de >100 organoïdes dérivés de patients représentant différents sous-types de cancer du sein a été développée par le groupe Hans Clevers36,37. Dans le cadre de cet effort, le groupe Clevers a également développé le premier milieu de culture complexe pour la croissance organoïde mammaire, qui est actuellement largement utilisé36. Une étude de suivi a fourni un compte rendu complet de l’établissement et de la culture des AOP mammaires et des xénogreffes organoïdes dérivées de patientes (PDOX)38. Le laboratoire Welm a développé une vaste collection de modèles BC PDX et PDxO qui sont cultivés dans un milieu de croissance comparativement plus simple contenant du sérum bovin fœtal (FBS) et moins de facteurs de croissance39,40. Nous avons indépendamment développé et caractérisé un large éventail de modèles organoïdes de cancer du sein naïfs dérivés de patientes11, et participé à l’élaboration de modèles PDO BC dans le cadre de l’initiative HCMI21. Ici, nous visons à fournir un guide pratique détaillant la méthodologie que nous employons pour générer des systèmes modèles organoïdes mammaires dérivés de patientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre laboratoire a utilisé avec succès les protocoles ci-dessus pour établir des organoïdes à partir de résections ou de raclages de tumeurs naïves. Nous avons également utilisé ce protocole pour développer des organoïdes normaux à partir de tissu mammaire obtenu par mammomoplasties réductrices ou à partir du tissu mammaire normal adjacent ou distal des patientes cancéreuses. Environ 30% à 40% des tumeurs primaires réséquées ont abouti à des cultures organoïdes tumorales réussies à long t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Spector pour les discussions critiques tout au long de ce travail. Nous remercions Norman Sachs et Hans Clevers (Hubrecht Institute, Pays-Bas) de nous avoir initialement fourni leur protocole de culture organoïde. Nous remercions les ressources partagées en histologie et microscopie du CSHL Cancer Center pour leurs services et leur expertise technique (NCI 2P3OCA45508). Nous remercions le Dr Qing Gao pour son aide dans la préparation des échantillons histologiques. Nous sommes reconnaissants du soutien de la Dre Karen Kostroff (Northwell Health) pour avoir fourni des échantillons de tumeurs aux patients. Nous apprécions également les efforts de l’équipe de Northwell Health Biobanking pour l’acquisition d’échantillons, et nous remercions les patients et leurs familles d’avoir fait don de tissus pour la recherche. Cette recherche a été financée par CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) et Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson et D.L.S).
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
Riferimenti
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