Demonstration des DNA-Faser-Assays zur Untersuchung von DNA-Schäden und Reparaturdynamik durch Nanopartikel

Summary

Die Methodik hilft bei der Analyse der Variation der DNA-Replikationsdynamik in Gegenwart von Nanopartikeln. Je nach Zytotoxizität des interessierenden Materials können unterschiedliche Methoden angewendet werden. Darüber hinaus wird eine Beschreibung der Bildanalyse bereitgestellt, um bei der DNA-Faseranalyse zu helfen.

Abstract

Die Exposition gegenüber Nanomaterialien kann zu Replikationsstress und genomischer Instabilität in Zellen führen. Der Grad der Instabilität hängt von der Chemie, der Größe und Konzentration der Nanomaterialien, dem Zeitpunkt der Exposition und dem exponierten Zelltyp ab. Mehrere etablierte Methoden wurden verwendet, um aufzuklären, wie endogene/exogene Wirkstoffe die globale Replikation beeinflussen. Assays auf Replikon-Ebene, wie z. B. der DNA-Faser-Assay, sind jedoch unerlässlich, um zu verstehen, wie diese Wirkstoffe die Initiierung, den Abbruch und die Progression der Replikationsgabel beeinflussen. Wenn man dies weiß, kann man besser verstehen, wie Nanomaterialien die Wahrscheinlichkeit einer Mutationsfixierung und genomischen Instabilität erhöhen. Wir verwendeten RAW 264.7 Makrophagen als Modellzellen, um die Replikationsdynamik unter Graphenoxid-Nanopartikel-Exposition zu untersuchen. Hier demonstrieren wir das grundlegende Protokoll für den DNA-Faserassay, das die Pulsmarkierung mit Nukleotidanaloga, die Zelllyse, das Verteilen der pulsmarkierten DNA-Fasern auf Objektträger, die fluoreszierende Immunfärbung der Nukleotidanaloga innerhalb der DNA-Fasern, die Bildgebung der Replikationsintermediate innerhalb der DNA-Fasern mittels konfokaler Mikroskopie und die Replikations-Zwischenanalyse mit einer computergestützten Scoring- und Analysesoftware (CASA) umfasst.

Introduction

Während jedes Zellzyklus sorgt die DNA-Replikation für eine genaue Genomduplikation¹. Die eukaryotische chromosomale Replikation hängt im Wesentlichen von drei Faktoren ab: dem Zeitpunkt des Auslösens mehrerer Replikationsurlinge, der Geschwindigkeit der Forks, die aus den gefeuerten Ursprüngen hervorgehen, und der Beendigung des Replikationsprozesses, wenn zwei Replikationsforks von benachbarten Ursprüngen aufeinandertreffen². Für die hochgenaue Übertragung genetischer Informationen an Tochterzellen sowie für den Erhalt der genetischen Integrität ist eine genaue DNA-Replikation von entscheidender Bedeutung. Wirkstoffe, die sich aus einem normalen Stoffwechsel entwickeln oder auf künstliche oder natürliche Umweltmaterialien zurückzuführen sind, greifen das Genom ständig an. Diese endogenen und exogenen Agenzien führen dazu, dass die Replikationsgabeln aufgrund von DNA-Schäden, die durch diese Agenzien verursacht werden, verlangsamt oder gestoppt werden, und dass die Gabeln als Reaktion auf diese Schwierigkeiten vorübergehend verlangsamt oder gestoppt werden, wird als Replikationsstress³ bezeichnet. Als Reaktion auf Replikationsstress haben Zellen mehrere molekulare Signalwege entwickelt, die die Stabilität der gestörten Replikationsgabeln aufrechterhalten und es ihnen ermöglichen, neu zu starten⁴. In Bezug auf die genetische Stabilität, das Überleben von Zellen und menschliche Krankheiten haben sich diese Mechanismen der Replikationsstressreaktion als Schlüsselfaktoren für die Aufrechterhaltung eines gesunden Genoms, die Sicherung des Zellüberlebens und die Verringerung der Wahrscheinlichkeit der Entstehung von Krankheiten herausgestellt⁵.

Einer der exogenen Wirkstoffe, die in der Lage sind, Replikationsstress zu erzeugen, sind Nanopartikel. Nanopartikel sind Partikel mit einer Größe von 1 nm bis 100 nm⁶. Aufgrund ihrer großen Oberfläche, ihrer unverwechselbaren Formen und ihrer einzigartigen chemischen Eigenschaften werden Nanopartikel in verschiedenen medizinischen, pharmazeutischen, ökologischen und industriellen Anwendungen eingesetzt ^7,8. Während Nanopartikel viele potenzielle Vorteile haben, können einige von ihnen (aufgrund ihrer vererbten Natur oder Langlebigkeit) giftig werden. Nanopartikel können sich auch durch den natürlichen Verschleiß medizinischer Implantate bilden und in den periprothetischen Bereich freigesetzt werden ^9,10.

Aufgrund der Exposition des Menschen gegenüber einer Vielzahl von Nanopartikeln, die für verschiedene Anwendungen hergestellt werden, hat die Forschung auf dem Gebiet der Toxizität von Nanopartikeln in den letzten 10 Jahren enorm zugenommen¹¹. Während diese Forschungsbemühungen eine Fülle von Informationen über die potenzielle Bedrohung durch Nanopartikel für die menschliche Gesundheit zutage gefördert haben, ist das Wissen über das Potenzial von Nanopartikeln, Genotoxizität zu verursachen, immer noch begrenzt. Bisher wurde entdeckt, dass diese Nanopartikel physikalisch mit der DNA interagieren, DNA-Schäden fördern und die Proteine, die für die Reparatur oder Replikation von DNA verantwortlich sind, beschädigen oder stören können¹². Um zu erkennen, wie sie die DNA-Replikation stören, werden in der Regel DNA-Faserkämmen, strahlenresistente DNA-Synthese (RDS) und DNA-Faseranalyse verwendet^13,14,15,16.

Die DNA-Faserkämmmethode ist flexibel und gibt Aufschluss über die Dynamik der Replikationsgabel auf Einzelmolekülebene¹⁷. Im Wesentlichen wird ein versalzenes Deckglas vorsichtig aus der DNA-Lösung herausgezogen, sobald die DNA-Enden daran binden. Die DNA-Moleküle werden durch den Meniskus der Lösung begradigt und ausgerichtet. Die Homogenität, der Abstand und die Ausrichtung der DNA-Fasern unterstützen genaue und zuverlässige Messungen der Länge des Faserstrangs. Durch die Anpassung der Länge und Abfolge der Behandlungen und der Medikamente, die verwendet werden, um Stress oder Schäden zu verursachen, können viele Aspekte des Gabelfortschritts mit dieser Anwendung überwacht werden. Bei dieser Methode wird ein duales Labeling-System verwendet, mit dem die Geschwindigkeit und der Fortschritt der Replikationsgabel bewertet werden^17,18. Auf der anderen Seite macht sich die 2D-Gelelektrophorese die Tatsache zunutze, dass sich bei der Agarose-Gelelektrophorese verzweigte DNA-Strukturen langsamer bewegen als lineare DNA-Moleküle gleicher Masse, was eine saubere Trennung der beiden in einem 2D-Lauf ermöglicht. Tatsächlich wird diese Methode untersucht, um DNA-Moleküle im ersten Durchlauf nach ihrer Masse und im zweiten orthogonalen Durchlauf nach ihrer Form zu trennen. Nach genomischer DNA-Fragmentierung entwickeln die ungewöhnlichen Replikations- und Rekombinationsintermediate eine verzweigte Form, und sie können von den häufigeren linearen Molekülen im 2D-Gel¹⁹ unterschieden werden.

Die RDS-Methode wird verwendet, um zu bestimmen, wie die globale DNA-Synthese beeinflusst wird. Bei dieser Methode wird der Grad der Hemmung der globalen Replikation bestimmt, indem die Menge der eingebauten radioaktiv markierten Nukleotide, wie z. B. [14C]Thymidin, in unbehandelten und behandelten Zellen verglichen wird^14,20. Der prozentuale Unterschied in der radioaktiven Markierung zwischen den unbehandelten und den behandelten Zellen stellt das Ausmaß dar, in dem der DNA-schädigende Wirkstoff die DNA-Synthese beeinflusst. In ähnlicher Weise nutzt eine andere Methode die Fähigkeit von Zellen, Nukleotidanaloga wie BrdU (5-Brom-2′-desoxyuridin) für die Durchflusszytometrie zu integrieren, um die Gesamtraten der DNA-Synthese zu messen^21,22. Diese Methoden zeigen zwar, wie DNA-schädigende Wirkstoffe die globale DNA-Synthese beeinflussen, aber nicht, wie einzelne Replikons betroffen sind. In der Tat sind Assays auf Replicon-Ebene unerlässlich, um die Entstehung und das Ausmaß der genomischen Instabilität im Falle einer Exposition gegenüber toxischen Partikeln (Nanomaterialien) besser zu verstehen. DNA-Faser-Autoradiographie und Elektronenmikroskopie sind einige Methoden, die verwendet werden, um dies zu bestimmen^23,24,25,26.

Die Konzepte der Replikationsblasen und der bidirektionalen Replikation aus ungleichmäßig verteilten Quellen wurden zunächst mit Hilfe von Einzelmolekültests wie Elektronenmikroskopie und DNA-Faser-Autoradiographie entwickelt^27,28. Die direkte Beobachtung von verzweigten Replikationszwischenprodukten auf bestimmten Molekülen, die über ein kohlenstoffbeschichtetes Gitter verteilt sind, wird durch die Elektronenmikroskopie erheblich erleichtert. Diese Methode, die auch heute noch verwendet wird, um pathologische Verschiebungen an Replikationsgabeln zu verfolgen, wurde verwendet, um den ersten eukaryotischen Ursprung der DNA-Replikation zu lokalisieren²⁸. Die Faserautoradiographie konzentriert sich auf das Konzept der autoradiographischen Identifizierung neu replizierter Areale und der Pulsmarkierung von Chromosomen mit tritiiertem Thymidin. Die erste quantitative Auswertung von Herkunftsdichten und Replikationsgabelraten in genomischen Sequenzen von Metazoen wurde durch DNA-Faser-Autoradiographie^{ermöglicht 29}.

Derzeit haben Faserfluorographiemethoden die Autoradiographie ersetzt, vor allem, weil die Faserfluorographie viel schneller ist als die Autoradiographie. Bei der Faserfluorographie werden zwei halogenierte Nukleotidderivate, wie Brom- (Br), Chlor- (Cl) oder Iododesoxyuridin (IdU), nacheinander in frisch replizierte DNA eingebaut und dann durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern^{identifiziert 30}. Die mikroskopische Betrachtung der entstehenden DNA, die eines oder beide Analoga eingebaut hat, wird durch Immunfärbung eines der Analoga in einer Farbe und des anderen Analogons in einer anderen Farbe ermöglicht (z. B. Immunfärbung der entstehenden DNA mit eingebautem IdU-Rot und eingebautem CldU-Grün) (Abbildung 1)²¹. Viele verschiedene Arten von Replikationszwischenprodukten können durch DNA-Faseranalyse identifiziert werden. Die am häufigsten untersuchten sind einzelne Verlängerungsgabeln, Initiationen und Abschlüsse. Einzelne längliche Gabeln haben ein Replikationsmuster von Rot gefolgt von Grün (Rot-Grün; Abbildung 2A). ¹³ Die Längen dieser Zwischenprodukte werden häufig verwendet, um die Gabelgeschwindigkeit (d. h. die Gabellänge/Pulszeit) oder den exonukleolytischen Abbau von entstehender DNA durch Spurverkürzung zu messen (Abbildung 2E)^30,31,32. In einer Studie von Mimitou et al. wurde festgestellt, dass bei langfristiger Exposition gegenüber Hydroxyharnstoff, einem Replikationsgift, das Doppelstrangbrüche in der DNA verursacht, RE11 rekrutiert wurde³³. MRE11 ist eine Exonuklease, die für ihre 3′-5′-Exonuklease-Aktivität bekannt ist und in der Lage ist, die Enden der DNA zur Reparatur zu durchtrennen. Daher kann man, wenn man toxischen Stoffen ausgesetzt ist, einen exonukleolytischen Abbau von entstehender DNA beobachten, d. h. die Verkürzung des DNA-Strangs aufgrund der Exposition gegenüber einem DNA-schädigenden Mittel³⁴.

Brüche der Replikationsgabel, die durch physikalische Obstruktionen (DNA-Protein-Komplexe oder DNA-Läsionen), chemische Hindernisse oder Mutationen verursacht werden, können die Replikation stoppen und eine homologe Rekombination erfordern, um sie neu zu starten. Dies wird als beeinträchtigte Gabelprogression bezeichnet. Zahlreiche In-vitro – und In-vivo-Untersuchungen haben gezeigt, dass die Transkription gelegentlich das Fortschreiten der Replikationsgabel auf diese Weise verhindern kann³⁵.

Initiationen sind Replikationsurmen, die während des ersten oder zweiten Impulses ausgelöst werden. Ursprünge, die während des ersten Impulses ausgelöst werden und Replikationsgabeln haben, die weiterhin aktiv sind, weisen ein grün-rot-grünes Muster auf (Abbildung 2B, unten). Ursprünge, die während des zweiten Pulses initiiert werden, haben ein rein grünes Muster (Abbildung 2B, oben) und werden manchmal als neu initiierte Ursprünge bezeichnet, sodass diese Ursprünge von denen unterschieden werden können, die während des ersten Pulses initiiert werden. Der Vergleich der relativen Prozentsätze der neu gebrannten Ursprünge zwischen zwei experimentellen Bedingungen ermöglicht es zu verstehen, wie eine Zelle auf einen DNA-schädigenden Wirkstoff oder das Vorhandensein oder Fehlen eines Proteins reagiert. Terminierungen werden erstellt, wenn zwei Replikationszweige aus benachbarten Replicons zusammengeführt werden, und sie weisen ein rot-grün-rotes Muster auf (Abbildung 2D)³⁰.

Basierend auf den oben beschriebenen Fakten wird die DNA-Faseranalyse derzeit als bevorzugte Methode angesehen, um die Variation der DNA-Replikationsdynamik zu untersuchen, die durch toxische Substanzen wie Nanomaterialien verursacht wird. Dank der Entdeckung dieser Technologie verfügen die Forscher nun über ein gutes Verständnis und Wissen über die Dynamik der genomweiten DNA-Replikation in Eukaryoten, sowohl quantitativ als auch qualitativ³⁶. Basierend auf den Ergebnisvariablen können verschiedene Methoden angewendet werden. Einige Beispiele für Methoden zur Untersuchung der Variationen von DNA-Schäden, die durch äußere Einflüsse/Nanopartikel induziert werden, sind in Abbildung 3 dargestellt. Das übergeordnete Ziel der in dieser Arbeit beschriebenen DNA-Faseranalysemethode ist es, zu bestimmen, wie Nanopartikel den Replikationsprozess in vitro beeinflussen und wie sie verschiedene Gewebe unterschiedlich beeinflussen.

Protocol

1. Herstellung von Antikörpern und Puffer Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung, Maus-Anti-BrdU in einer Verdünnung von 1:300 in 5 % BSA und Ratten-Anti-BrdU in einer Verdünnung von 1:500 in 5 % BSA vor. Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung, Alexafluor 594 Kaninchen-Anti-Maus in einer Verdünnung von 1:300 in 5 % BSA und Alexafluor 488 Huhn-Anti-Ratte in einer Verdünnung von 1:500 in 5 % BSA vor. Bereiten Sie die tertiäre Antikörperlösung, Alexafluor …

Representative Results

Nachdem genügend Bilder (von 20-100 Bildern pro Bedingung) erhalten wurden, müssen die Replikationszwischenprodukte identifiziert, gemessen und gezählt werden. Unabhängig davon, ob die Fasern manuell oder automatisch über ein Programm38 analysiert werden, muss klar definiert werden, welche Eigenschaften eine Faser aufweisen muss, damit sie gezählt oder bewertet (oder nicht gezählt oder gemessen) werden kann39. Zum Beispiel können die folgenden Fragen in Bet…

Discussion

Wir diskutieren hier eine Methode, die bei der Analyse der Variation der DNA-Replikationsdynamik in Gegenwart von Nanopartikeln durch den DNA-Faser-Assay hilft. Die wichtigsten kritischen Schritte des Standardtests sind im Protokoll beschrieben (Schritt 2.2.2 und Schritt 3.1.3). Es wird immer empfohlen, einen Bereich mit begrenzter Lichteinwirkung von oben und konstantem Luftstrom zu verwenden, um lichtinduzierte DNA-Brüche in den Objektträgern zu vermeiden und die Reproduzierbarkeit zu verbessern. Besonderes Augenmerk…

Materials

24 well plate	Fisher brand	FB012929
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit	Invitrogen	A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat	Invitrogen	A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse	Invitrogen	A11062
BSA	Sigma Aldrich	A2153
CldU	Sigma Aldrich	50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm)	Fisher brand	12-545-EP
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Frosted Microscope Slides	Fisher brand	12-550-11
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
IdU	Sigma Aldrich	54-42-2
Methanol	Fisher Scientific	A454-4
Mouse Anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Phosphate Buffer Saline	Gibco	10010072
Rat anti-BrdU	Abcam	BU1–75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells	ATCC	TIB-71
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Silane-Prep slides	Sigma Aldrich	S4651-72EA
Superfrost gold plus slides	Fischer scientific	22-035813
Tris pH 7.4	Sigma Aldrich	77861
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416