הדגמה של בדיקת סיבי DNA לחקר נזק לדנ"א ודינמיקת תיקון הנגרמת על ידי ננו-חלקיקים

Summary

המתודולוגיה מסייעת בניתוח השונות בדינמיקה של שכפול DNA בנוכחות ננו-חלקיקים. ניתן לאמץ מתודולוגיות שונות המבוססות על רמת ציטוטוקסיות של החומר המעניין. בנוסף, תיאור של ניתוח התמונה מסופק כדי לסייע בניתוח סיבי DNA.

Abstract

חשיפה לננו-חומרים עלולה לגרום לעקה של שכפול ולחוסר יציבות גנומית בתאים. מידת חוסר היציבות תלויה בכימיה, בגודל ובריכוז של הננו-חומרים, בזמן החשיפה ובסוג התא החשוף. מספר שיטות מבוססות שימשו כדי להבהיר כיצד סוכנים אנדוגניים/אקסוגניים משפיעים על שכפול גלובלי. עם זאת, בדיקות ברמת הרפליקון, כגון בדיקת סיבי DNA, הכרחיות כדי להבין כיצד סוכנים אלה משפיעים על התחלת השכפול, הסיומות והתקדמות מזלג השכפול. ידיעה זו מאפשרת להבין טוב יותר כיצד ננו-חומרים מגדילים את הסיכויים לקיבוע מוטציות ולחוסר יציבות גנומית. השתמשנו במקרופאגים RAW 264.7 כתאי מודל כדי לחקור את דינמיקת השכפול תחת חשיפה לננו-חלקיקים של תחמוצת גרפן. כאן, אנו מדגימים את הפרוטוקול הבסיסי לבדיקת סיבי DNA, הכולל תיוג פולסים עם אנלוגים של נוקלאוטידים, ליזה של תאים, פיזור סיבי הדנ”א המסומנים בדופק על שקופיות, אימונוסטיישן פלואורסצנטי של אנלוגים לנוקלאוטידים בתוך סיבי הדנ”א, הדמיה של מתווכי השכפול בתוך סיבי הדנ”א באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח ביניים של שכפול באמצעות תוכנת ניקוד וניתוח בסיוע מחשב (CASA).

Introduction

במהלך כל מחזור תא, שכפול DNA מבטיח שכפול גנום מדויק¹. שכפול כרומוזומלי אאוקריוטי תלוי למעשה בשלושה גורמים: עיתוי הירי של מקורות שכפול מרובים, מהירות המזלגות היוצאים ממקורות השכפול, וסיום תהליך השכפול כאשר שני מזלגות שכפול ממקורות סמוכים נפגשים². להעברה בנאמנות גבוהה של מידע גנטי לתאי בת, כמו גם לשמירה על שלמות גנטית, שכפול DNA מדויק הוא חיוני. סוכנים המתפתחים מחילוף חומרים רגיל או נובעים מחומרים סביבתיים מלאכותיים או טבעיים תוקפים ללא הרף את הגנום. חומרים אנדוגניים ואקסוגניים אלה גורמים למזלגות השכפול להאט או לעצור עקב מפגש עם נזק לדנ”א שנגרם על ידי סוכנים אלה, והמזלגות המאטים או נעצרים באופן זמני בתגובה לקשיים אלה נקראים לחץ שכפול³. בתגובה לעקת השכפול, התאים פיתחו מספר מסלולים מולקולריים השומרים על יציבות מזלגות השכפול המופרעים ומאפשרים להם להפעיל מחדש⁴. במונחים של יציבות גנטית, הישרדות תאים ומחלות אנושיות, מנגנוני תגובת עקה אלה התגלו כגורמי המפתח לשמירה על גנום בריא, הבטחת הישרדות התא והפחתת הסבירות להיווצרות מחלות⁵.

אחד הסוכנים האקסוגניים המסוגלים לייצר לחץ שכפול הוא ננו-חלקיקים. ננו-חלקיקים הם חלקיקים שגודלם נע בין 1 ננומטר ל-100 ננומטר⁶. בשל שטחי הפנים הגבוהים שלהם, צורותיהם הייחודיות ותכונותיהם הכימיות הייחודיות, ננו-חלקיקים משמשים במגוון יישומים רפואיים, פרמצבטיים, סביבתיים ותעשייתיים ^7,8. בעוד שלננו-חלקיקים יש יתרונות פוטנציאליים רבים, חלקם (בשל טבעם התורשתי או אריכות ימיהם) יכולים להפוך רעילים. ננו-חלקיקים יכולים להיווצר גם עקב הבלאי הטבעי של שתלים רפואיים ולהשתחרר לאזור הפרי-תותב ^9,10.

בשל חשיפת בני האדם למספר עצום של ננו-חלקיקים המיוצרים עבור יישומים שונים, המחקר בתחום רעילות ננו-חלקיקים גדל מאוד במהלך 10 השנים האחרונות¹¹. בעוד מאמצי מחקר אלה חשפו מידע בשפע על האיום הפוטנציאלי שננו-חלקיקים מהווים לבריאות האדם, הידע על הפוטנציאל של ננו-חלקיקים לגרום לגנוטוקסיות עדיין מוגבל. מה שהתגלה עד כה הוא שננו-חלקיקים אלה יכולים לקיים אינטראקציה פיזית עם הדנ”א, לקדם נזק לדנ”א ולפגוע או להפריע לחלבונים האחראים לתיקון או שכפול דנ”א¹². כדי לזהות כיצד הם מפריעים לשכפול DNA, משתמשים בדרך כלל בסירוק סיבי DNA, סינתזת DNA עמיד לרדיו (RDS) וניתוח סיבי DNA 13,14,15,16.

שיטת סירוק סיבי הדנ”א גמישה ומספקת מידע על דינמיקת מזלג השכפול ברמת המולקולה הבודדת¹⁷. בעיקרו של דבר, כיסוי מומלח נשלף בעדינות מתמיסת הדנ”א ברגע שקצה הדנ”א נקשר אליו. מולקולות הדנ”א מיושרות ומיושרות על ידי המניסקוס של התמיסה. ההומוגניות, הריווח והיישור של סיבי הדנ”א תומכים במדידות מדויקות ומהימנות של אורך מערכת הסיבים. על ידי התאמת אורך ורצף הטיפולים והתרופות המשמשות לגרימת מתח או נזק, ניתן לעקוב אחר היבטים רבים של התקדמות המזלג באמצעות יישום זה. בשיטה זו נעשה שימוש במערכת תיוג כפולה, שבאמצעותה מעריכים את המהירות וההתקדמות של מזלג השכפול^17,18. מצד שני, אלקטרופורזה של ג’ל דו-ממדי מנצלת את העובדה שבאלקטרופורזה של ג’ל אגרוז, מבני דנ”א מסתעפים נעים לאט יותר מאשר מולקולות דנ”א ליניאריות בעלות אותה מסה, מה שמאפשר הפרדה נקייה בין השניים בריצה דו-ממדית. למעשה, שיטה זו נחקרת כדי להפריד מולקולות DNA בהתבסס על המסה שלהם בסיבוב הראשון ועל בסיס צורתן בריצה האורתוגונלית השנייה. לאחר פיצול הדנ”א הגנומי, מתווכי השכפול והרקומבינציה הנדירים מפתחים צורת הסתעפות, וניתן להבדיל בינם לבין המולקולות הליניאריות הנפוצות יותר בג’ל הדו-ממדי¹⁹.

שיטת RDS משמשת לקביעת האופן שבו סינתזת DNA גלובלית מושפעת. בשיטה זו, מידת העיכוב של שכפול גלובלי נקבעת על ידי השוואת כמות הנוקלאוטידים המסומנים רדיואקטיבית, כגון [14C] תימידין, בתאים לא מטופלים לעומת^14,20. ההבדל באחוזים בתיוג הרדיו בין התאים הלא מטופלים למטופלים מייצג את המידה שבה הגורם המזיק לדנ”א משפיע על סינתזת הדנ”א. בדומה לכך, שיטה אחרת משתמשת ביכולתם של תאים לשלב אנלוגים של נוקלאוטידים כמו BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) עבור ציטומטריית זרימה כדי למדוד את השיעורים הכוללים של סינתזת DNA^21,22. בעוד ששיטות אלה מדגימות כיצד גורמים הפוגעים בדנ”א משפיעים על סינתזת דנ”א גלובלית, הן אינן מראות כיצד מגיבים בודדים מושפעים. אכן, בדיקות ברמת הרפליקון הכרחיות כדי להבין טוב יותר את ההתחלה וההיקף של חוסר יציבות גנומית במקרה של חשיפה לחלקיקים רעילים (ננו-חומר). אוטורדיוגרפיה של סיבי DNA ומיקרוסקופ אלקטרונים הן כמה שיטות המשמשות כדי לקבוע את^{זה 23,24,25,26}.

המושגים של בועות שכפול ושכפול דו-כיווני ממקורות במרווחים לא שווים פותחו לראשונה באמצעות בדיקות של מולקולות בודדות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים ואוטורדיוגרפיה של סיבי DNA^27,28. התצפית הישירה של מתווכי שכפול מסתעפים על מולקולות ספציפיות המפוזרות על פני רשת מצופה פחמן מתאפשרת במידה רבה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. שיטה זו, המשמשת עד היום למעקב אחר שינויים פתולוגיים במזלגות שכפול, שימשה לאיתור המקור האיקריוטי הראשון של שכפול דנ”א²⁸. אוטורדיוגרפיה של סיבים מתרכזת סביב הרעיון של זיהוי אוטורדיוגרפי של אזורים משוכפלים חדשים ותיוג הדופק של כרומוזומים עם תימידין טריטי. ההערכה הכמותית הראשונה של צפיפות המקור ושיעורי פיצול השכפול ברצפים גנומיים מטזואיים התאפשרה על ידי אוטורדיוגרפיה של סיבי DNA²⁹.

נכון לעכשיו, שיטות פלואורוגרפיה סיבים תפסו את מקומה של אוטורדיוגרפיה, בעיקר משום שפלואורוגרפיית סיבים מהירה בהרבה מאוטורדיוגרפיה. בפלואורוגרפיה של סיבים, שתי נגזרות נוקלאוטידים הלוגניות, כגון ברומו- (Br), כלורו- (Cl), או יודאודוקסיורידין (IdU), משולבות ברצף בדנ”א משוכפל טרי ולאחר מכן מזוהות על ידי אימונופלואורסנציה עקיפה באמצעות נוגדנים³⁰. צפייה מיקרוסקופית של הדנ”א המתהווה ששילב אנלוגים אחד או שניהם מתאפשרת על-ידי צביעה חיסונית של אחד האנלוגים בצבע אחד ושל האנלוגים האחרים בצבע אחר (למשל, צביעה חיסונית של דנ”א מתהווה עם אדום IdU משולב וירוק CldU משולב) (איור 1)²¹. ניתן לזהות סוגים רבים ושונים של מתווכי שכפול על ידי ניתוח סיבי DNA. הנפוצים ביותר הם מזלגות התארכות בודדים, חניכות וסיומות. למזלגות מתארכים בודדים יש תבנית שכפול של אדום ואחריו ירוק (אדום-ירוק; איור 2A). ¹³ אורכי המתווכים האלה משמשים לעתים קרובות למדידת מהירות המזלג (כלומר, אורך המזלג/זמן הדופק) או הפירוק האקסונוקלאוליטי של דנ”א מתהווה באמצעות קיצור מסלול (איור 2E)^30,31,32. במחקר של Mimitou et al., נמצא כי בחשיפה ארוכת טווח להידרוקסיוריאה, רעל שכפול הגורם לשברים דו-גדיליים בדנ”א, RE11 גויס³³. MRE11 הוא אקסונוקלאז הידוע בפעילות האקסונוקלאז 3′-5′ שלו, והוא מסוגל לחתוך את קצות הדנ”א לתיקון. לכן, כאשר נחשפים לחומרים רעילים, ניתן להבחין בהתפרקות אקסונוקלאוליטית של דנ”א מתהווה, שהיא קיצור גדיל הדנ”א עקב חשיפה לחומר הפוגע בדנ”א³⁴.

שבירת מזלג השכפול הנגרמת על ידי חסימות פיזיות (קומפלקסים של חלבוני DNA או נגעים בדנ”א), מכשולים כימיים או מוטציות עשויות לעצור את השכפול ולחייב רקומבינציה הומולוגית כדי להפעיל אותו מחדש. תופעה זו ידועה בשם התקדמות מזלג לקויה. מחקרים רבים במבחנה ו-in vivo הצביעו על כך שתמלול עשוי, לעיתים, למנוע התקדמות מזלג שכפול באופן זה³⁵ .

חניכות הן מקורות שכפול היוזמים ויורים במהלך הפעימה הראשונה או השנייה. למקורות שיורים במהלך הפעימה הראשונה ויש להם מזלגות שכפול שממשיכים להיות פעילים יש תבנית ירוקה-אדומה-ירוקה (איור 2B, נמוך יותר). למקורות שמתחילים במהלך הפעימה השנייה יש תבנית ירוקה בלבד (איור 2B, עליון) ולפעמים הם נקראים מקורות שהתחילו לאחרונה, כך שאפשר להבדיל בין המקורות האלה לאלה שמתחילים במהלך הפעימה הראשונה. השוואת האחוזים היחסיים של מקורות חדשים שנורו בין שני תנאי ניסוי מאפשרת להבין כיצד תא מגיב לחומר המזיק לדנ”א או לנוכחות או היעדר חלבון. סיומות נוצרות כאשר שני מזלגות שכפול מרפליקונים סמוכים מתמזגים, ויש להם תבנית אדומה-ירוקה-אדומה (איור 2D)³⁰.

בהתבסס על העובדות שתוארו לעיל, ניתוח סיבי דנ”א נחשב כיום לשיטה מועדפת לחקר השונות בדינמיקת שכפול הדנ”א הנגרמת על ידי חומרים רעילים כגון ננו-חומרים. לחוקרים יש כיום הבנה טובה וידע על הדינמיקה של שכפול דנ”א כלל גנומי באיקריוטים, הן מבחינה כמותית והן מבחינה איכותית, הודות לגילוי טכנולוגיה זו³⁶. בהתבסס על משתני התוצאה, ניתן לאמץ מספר מתודולוגיות. כמה דוגמאות לשיטות לחקור את השינויים בנזק לדנ”א שנגרם על-ידי סוכנים חיצוניים/ננו-חלקיקים מוצגות באיור 3. המטרה הכוללת של שיטת ניתוח סיבי הדנ”א המתוארת במחקר זה היא לקבוע כיצד ננו-חלקיקים משפיעים על תהליך השכפול במבחנה וכיצד הם משפיעים באופן דיפרנציאלי על רקמות שונות.

Protocol

1. הכנת נוגדנים וחיץ הכינו את תמיסת הנוגדנים העיקרית, אנטי-BrdU עכברי בדילול 1:300 ב-5% BSA ואנטי-BrdU חולדה בדילול 1:500 ב-5% BSA. הכינו את תמיסת הנוגדנים המשנית, alexafluor 594 ארנב נגד עכבר בדילול 1:300 ב-5% BSA ו-alexafluor 488 עוף נגד חולדה בדילול 1:500 ב-5% BSA. הכינו את תמיסת הנוגדנים השלישונית, alexaflu…

Representative Results

לאחר קבלת מספיק תמונות (מ 20-100 תמונות לכל תנאי), יש לזהות, למדוד ולספור את מתווכי השכפול. בין אם מנתחים את הסיבים באופן ידני או אוטומטי באמצעות תוכנית38, יש צורך להגדיר בבירור אילו מאפיינים חייבים להיות לסיב כדי שהוא ייספר או יקבל ניקוד (או לא ייספר או יימדד)39. לד?…

Discussion

אנו דנים כאן בשיטה שתסייע בניתוח השונות בדינמיקת שכפול הדנ”א בנוכחות ננו-חלקיקים באמצעות בדיקת סיבי הדנ”א. השלבים הקריטיים העיקריים המעורבים בבדיקה הסטנדרטית מתוארים בפרוטוקול (שלב 2.2.2 ושלב 3.1.3). מומלץ תמיד להשתמש באזור עם חשיפה מוגבלת לאור עילי וזרימת אוויר קבועה כדי למנוע הפסקות DNA המושר…

Materials

24 well plate	Fisher brand	FB012929
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit	Invitrogen	A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat	Invitrogen	A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse	Invitrogen	A11062
BSA	Sigma Aldrich	A2153
CldU	Sigma Aldrich	50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm)	Fisher brand	12-545-EP
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Frosted Microscope Slides	Fisher brand	12-550-11
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
IdU	Sigma Aldrich	54-42-2
Methanol	Fisher Scientific	A454-4
Mouse Anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Phosphate Buffer Saline	Gibco	10010072
Rat anti-BrdU	Abcam	BU1–75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells	ATCC	TIB-71
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Silane-Prep slides	Sigma Aldrich	S4651-72EA
Superfrost gold plus slides	Fischer scientific	22-035813
Tris pH 7.4	Sigma Aldrich	77861
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416