Organoid-fibroblast co-kulturer giver en model til at studere in vivo stamcelleniche. Her beskrives en protokol for esophageal organoid-fibroblast co-kulturer. Derudover bruges helmonteret billeddannelse til at visualisere fibroblast-organoid-interaktionen.
Epitelstamceller og stamceller bidrager til dannelsen og vedligeholdelsen af epitelbarrieren gennem hele livet. De fleste stam- og stamcellepopulationer er gemt væk på anatomisk forskellige steder, hvilket muliggør eksklusive interaktioner med nichesignaler, der opretholder stammen. Mens udviklingen af epitelorganoidkulturer giver et kraftfuldt værktøj til at forstå stam- og stamcellers rolle i homeostase og sygdom, er interaktionen inden for nichemiljøet stort set fraværende, hvilket forhindrer identifikation af faktorer, der påvirker stamcelleadfærd. Fibroblaster spiller en central rolle i styringen af epitelstammen og stamfaderens skæbne. Her præsenteres en omfattende organoid-fibroblast-cokulturprotokol, der muliggør afgrænsning af fibroblastsubpopulationer i esophageal stamcellefornyelse og differentiering. I denne protokol beskrives en metode til isolering af både epitelceller og fibroblaster parallelt fra spiserøret. Forskellige fluorescensaktiverede cellesorteringsstrategier til isolering af både esophageal stamceller såvel som fibroblast-subpopulationerne fra enten transgene reporter eller vildtypemus er skitseret. Denne protokol giver en alsidig tilgang, der kan tilpasses til at imødekomme isoleringen af specifikke fibroblastsubpopulationer. Etablering og overførsel af esophageal epitelorganoid monokulturer er inkluderet i denne protokol, hvilket muliggør en direkte sammenligning med co-kultursystemet. Derudover beskrives en 3D-clearing-tilgang, der muliggør detaljeret billedanalyse af epitel-fibroblast-interaktioner. Samlet beskriver denne protokol en komparativ og relativt høj gennemstrømningsmetode til identifikation og forståelse af esophageal stamcellenichekomponenter in vitro.
Organoider anvendes som 3D in vitro-assays til at karakterisere stam- og stamceller samt til at forstå signalsignalsignalerne afledt af de cellulære komponenter i stamcellenichen 1,2,3,4. Mus esophageal organoider blev først beskrevet i 2014, og flere papirer har identificeret vækstfaktorer, som R-Spondin (RSPO), NOGGIN og epidermal vækstfaktor (EGF), der er nødvendige for at opretholde og passere esophageal organoider 5,6,7, idet de argumenterer for, at lignende signalsignaler er nødvendige for in vivo fornyelse af stamceller. Imidlertid tilsættes vækstfaktorer almindeligvis i ikke-fysiologiske koncentrationer, hvilket resulterer i organoide vækstbetingelser, som ikke nødvendigvis afspejler in vivo-signalmiljøet.
Fibroblaster er heterogene stromale cellepopulationer, der understøtter stamcelleegenskaber i mange stamcellenicher8. Kombination af epitelstamceller og fibroblaster i samme organoidkultur muliggør organoiddannelse i reducerede koncentrationer af eksogent supplerede vækstfaktorer. Organoid co-kultur systemer fra tarm og hepatisk epitel er beskrevet, men en protokol til etablering af esophageal organoid-fibroblast co-kulturer er stadig udestående 9,10,11.
I denne protokol skitseres to fluorescensaktiverede cellesorteringsstrategier (FACS) for fibroblaster fra spiserøret ved hjælp af enten transgene PdgfrαH2BeGFP-mus 12 eller vildtypemus med klassisk antistoffarvning. Forskellige subpopulationer af fibroblaster kan isoleres ved hjælp af valgte celleoverflademarkører, hvilket giver protokollen fleksibilitet. Derudover anvendes en 3D-fluorescensbilleddannelsesteknik, der bevarer organoidmorfologi, til at karakterisere fibroblast-organoidinteraktioner. Organoid clearing giver en hurtig metode til at øge lysindtrængningsdybden i organoiderne, forbedre visualiseringen af organoid-fibroblastforbindelser og muliggøre rekapitulation af organoidstrukturen i sin helhed. Denne protokol kombinerer esophageal organoid co-kultur med en hel mount imaging strategi, der muliggør funktionel karakterisering af fibroblast-organoid interaktion.
Protokollen, der præsenteres her, etablerer en in vitro-model til undersøgelse af funktionelle esophageal epitel-fibroblast-interaktioner.
Epitellaget er adskilt fra stroma, hvilket giver mulighed for en optimeret dissociationsprotokol for både epitel- og stromalrummet. På trods af optimering af epiteldissociationsprotokollen forbliver vævsklumper tydelige. Kraftig pipettering op og ned hvert 15. minut reducerer antallet og størrelsen af klumper betydeligt. Andre protokoller bruger trypsin til yderligere at dissociere epitellaget, 5,6. Her anbefales det ikke at bruge trypsin eller øge dissociationstiden yderligere, da dette har tendens til at resultere i nedsat epitelcellelevedygtighed og organoiddannende effektivitet. I modsætning til epitelet adskilles stroma let, og 30 min i dissociationsopløsning resulterer i en enkeltcellesuspension med ~ 90% fibroblastlevedygtighed (figur 1E). Udelukkelse af epitel-stomale separationstrin i protokollen øger dissociationstiden betydeligt, hvilket resulterer i en nedsat fibroblastlevedygtighed og et lavere udbytte af epitelceller. Derudover giver adskillelse af epitelet fra stroma mulighed for at bestemme celleantallet for hver population og blande epitelceller og fibroblaster fra forskellige muselinjer, når co-kulturerne oprettes.
Undersøgelse af fibroblastfunktion på organoidvækst er en almindeligt anvendt metode i stamcellebiologi 9,10,11,15,16. Etablerede co-kultur medier er enten DMEM suppleret med 10% føtal kalveserum (FCS)9,15 eller vækstfaktor reduceret medium10,16. I denne protokol bruges vækstfaktorreduceret medium til at efterligne forholdene i di vivo-stamcellenichen, hvor fibroblaster stort set er hvilende. FCS er et vækstfaktorrigt serum, som resulterer i aktivering og proliferation af fibroblaster i co-kulturerne, sandsynligvis svarende til en fibroblastcelletilstand, der adskiller sig fra in vivo-tilstanden. Ved at udelukke FCS og reducere vækstfaktorer, så mediet alene (ERlav) ikke understøtter organoidvækst og ikke stimulerer fibroblastproliferation, er det muligt at isolere fibroblasternes virkning på organoidvæksten. I dette medium fjernes NOGGIN og RSPO reduceres til et minimum (10% RPSO). Både NOGGIN og RSPO har vist sig at være afgørende for esophageal organoid vækst6. EGF blev bibeholdt i samkulturmediet, da det ikke i sig selv understøtter organoidvækst. Imidlertid er fibroblaster også i stand til at understøtte organoidvækst i et EGF-reduceret medium (Elav Rlav; Figur 2B, D).
Organoid co-kulturer kan ikke opretholdes gennem passaging som fibroblaster går tabt under trypsinisering. Imidlertid blev organoid passaging inkluderet i protokollen, da esophageal organoider kan opretholdes, udvides og anvendes til yderligere eksperimenter som monokulturer. Passagede organoider fra monokulturer kan bruges til at oprette co-kulturer med frisk isolerede fibroblaster. En ulempe ved at bruge primære celler er antallet af mus, der er nødvendige for at oprette flere organoide cokulturer. Når man fokuserer på små subpopulationer af fibroblaster, er antallet af opnåede cokulturer begrænset. I andre protokoller udvides fibroblaster først i kultur, før de bruges til at oprette organoide cokulturer10. Imidlertid ændrer fibroblaster morfologi og identitet under passage, vist ved anvendelse af primære hud- og hjertefibroblaster17,18. Konventionel 2D-passaging af esophageal fibroblaster resulterer i både morfologi og fænotypeændringer, hvilket viser, at di vitro-berigelse af fibroblaster ikke er egnet til cokulturer, der sigter mod fænokopi af den endogene stamcelleniche.
Helmonteret farvning giver et værktøj til at opretholde og visualisere fibroblast-organoidinteraktion. Det skal bemærkes, at selvom ikke alle organoider vil have fibroblaster direkte knyttet til dem, er de fleste organoider i kontakt med fibroblaster (se figur 2C). For at opretholde epitel-fibroblast-interaktioner er det vigtigt at håndtere organoiderne med omhu og undgå kraftig pipettering, hvirvelstrøm og højhastighedsspinding. Optimal fiksering er vigtig for at opretholde 3D-vævsarkitektur samt holde endogen fluorescens. En 30 minutters fiksering er tilstrækkelig til at bevare H2BeGFP-signalet og er optimal for de antistoffer, der anvendes i denne protokol, men dette kan variere mellem de anvendte fluoroforer og antistoffer. Rydning af organoiderne reducerer lysspredning og forbedrer visualiseringen af hele 3D-strukturen betydeligt. Da organoiderne er små, er rydning let og hurtig; Imidlertid kan billeddannelse af hele organoider ved hjælp af laserscanningskonfokalmikroskopi være tidskrævende, da der skal laves flere Z-stakke. Konfokale mikroskoper, som den roterende skive, kan bruges til at reducere billeddannelsestiden.
Samlet set giver esophageal organoider dyrket i nærvær af fibroblaster et værdifuldt værktøj til at forstå aspekter af esophageal stamcelleniche. Derudover giver helmonteringsrydning en tilgængelig metode til at visualisere interaktionen mellem fibroblaster og organoider.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af ERC StG TroyCAN (851241). E.E. er postdoc i Cancerfonden. M.G. er Ragnar Söderberg Fellow og Cancerfonden Junior Investigator. Vi er taknemmelige for den tekniske assistance fra Karolinska Institutet kernefaciliteter, herunder Biomedicum Flow Cytometry Core Facility, Biomedicum Imaging Core (BIC) og Comparative Medicine Biomedicum (KMB) dyrefacilitet. Vi takker medlemmer af Genander-laboratoriet for omhyggeligt at læse og kommentere protokollen.
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher (Gibco) | 17504001 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | fisher scientific | 356231 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher (Gibco) | 11320074 | |
DPBS | Thermo Fisher (Gibco) | 14190250 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher (Gibco) | 35050061 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 14175-129 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher (Gibco) | 15140122 | |
Triton X-100 solution | Merck | 93443-100ML | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 25200-056 | |
Chemicals, Peptides, and recombinant proteins | |||
DAPI Solution | Thermo Fisher | 62248 | |
Dissociation solution: 0.25 mg/ml Liberase TM, 0.25 mg/ml Dnase in HBSS | |||
Dnase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
Formaldehyde, 37%, with 10-15% methanol | Sigma-Aldrich | 252549-1L | |
Liberase | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
N-Acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
Noggin murine | Peprotech | 250-38 | |
RapiClear 1.47 | SunJin Lab | #RC147001 | |
Recombinant Mouse EGF Protein, CF | R&D systems | 2028-EG-200 | |
R-spondin-1 murine | Peprotech | 315-32 | |
SYTOX Blue Dead Cell Stain | Thermo Fisher | S34857 | |
Thermolysin | Sigma-Aldrich | T7902-25MG | |
Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503-5MG | |
Plastic & Glassware | |||
Corning Sterile Cell Strainers 40um | VWR | 15360801 | |
Corning Sterile Cell Strainers 70um | VWR | 431751 | |
Menzel Deckgläser/ cover slips | Thermo Fisher | Q10143263NR15 | |
SafeSeal reaction tube, 1.5 mL, PP | Sarstedt | 72.706 | |
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes 0.6 mL | Thermo Fisher | 3446 | |
SuperFrost Slides | VWR | 631-9483 | |
Tools | |||
0.05 mm 4 circular well iSpacer | SunJin Lab | #IS204 | |
Dumont #5 forceps, biology tip | F.S.T | 11252-20 | |
ImmEdge Pen | VectorLaboratories | H-4000 | |
Spring Scissors Angled to Side Ball Tip 8mm Cutting Edge | F.S.T | 15033-09 | |
Instruments | |||
Confocal microscope Stellaris 5 | Leica | ||
Dissection microscope ZEISS Stemi 305 | Zeiss | ||
FACS ARIA III | BD Biosciences | ||
Conjugated Antibodies for FACS | |||
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody Clone: 346-11A |
123608 | 123608 | |
APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Antibody | H194-112 | H194-112 | |
PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) Antibody | 147310 | 147310 | |
Antibodies for Immunofluorescence | |||
CD104 (ß-integrin 4) Clone: 346-11A |
BioLegend | 553745 | |
Cytokeratin 14 | Acris Antibodies (AbD Serotec) | BP5009 | |
Cytokeratin13 Clone: EPR3671 |
abcam | ab92551 | |
E-cadherin (CD324) Clone: 2.40E+11 |
Cell Signaling Technology | 3195 | |
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified Clone: Poly9059 |
BioLegend | 905901 | |
p63 Clone: 4a4 |
abcam | ab735 | |
Recombinant Anti-KLF4 antibod Clone: EPR20753-25 |
abcam | ab214666 | |
Vimentin | Sigma-Aldrich | AB5733 | |
Secondary antibodies | |||
Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice | Jackson Immuno |