Organoid-fibroblast co-kulturer gir en modell for å studere in vivo stamcelle nisje. Her beskrives en protokoll for esophageal organoid-fibroblast co-kulturer. I tillegg brukes helmonteringsavbildning til å visualisere fibroblast-organoid-interaksjonen.
Epitelstam- og stamceller bidrar til dannelse og vedlikehold av epitelbarrieren gjennom livet. De fleste stam- og stamcellepopulasjoner er gjemt bort på anatomisk forskjellige steder, noe som muliggjør eksklusive interaksjoner med nisjesignaler som opprettholder stammen. Mens utviklingen av epitelorganoidkulturer gir et kraftig verktøy for å forstå rollen som stam- og stamceller i homeostase og sykdom, er samspillet i nisjemiljøet stort sett fraværende, og hindrer dermed identifisering av faktorer som påvirker stamcelleadferd. Fibroblaster spiller en nøkkelrolle i å styre epitelstammen og stamfarens skjebne. Her presenteres en omfattende organoid-fibroblast samkulturprotokoll som muliggjør avgrensning av fibroblast-subpopulasjoner i esophageal progenitorcellefornyelse og differensiering. I denne protokollen beskrives en metode for å isolere både epitelceller og fibroblaster parallelt fra spiserøret. Distinkte fluorescensaktiverte cellesorteringsstrategier for å isolere både esophageal stamceller samt fibroblast-subpopulasjoner fra enten transgen reporter eller villtypemus er skissert. Denne protokollen gir en allsidig tilnærming som kan tilpasses for å imøtekomme isolering av spesifikke fibroblastunderpopulasjoner. Etablering og passering av esophageal epitelial organoid monokulturer er inkludert i denne protokollen, noe som muliggjør en direkte sammenligning med samkultursystemet. I tillegg beskrives en 3D-clearing-tilnærming som muliggjør detaljert bildeanalyse av epitel-fibroblast-interaksjoner. Samlet beskriver denne protokollen en komparativ og relativt høy gjennomstrømningsmetode for å identifisere og forstå esophageal stem cell nisjekomponenter in vitro.
Organoider brukes som 3D in vitro-analyser for å karakterisere stam- og stamceller, samt å forstå signalsignalene avledet fra de cellulære komponentene i stamcellenisjen 1,2,3,4. Musesophageal organoider ble først beskrevet i 2014, og flere papirer har identifisert vekstfaktorer, som R-Spondin (RSPO), NOGGIN og epidermal vekstfaktor (EGF), som trengs for å opprettholde og passere esophageal organoider 5,6,7, og hevder at lignende signalsignaler kreves for in vivo fornyelse av stamceller. Imidlertid blir vekstfaktorer ofte lagt til i ikke-fysiologiske konsentrasjoner, noe som resulterer i organoide vekstforhold som ikke nødvendigvis gjenspeiler in vivo-signalmiljøet.
Fibroblaster er heterogene stromale cellepopulasjoner som støtter stamcelleegenskaper i mange stamcellenisjer8. Kombinasjonen av epiteliale stamceller og fibroblaster i samme organoidkultur muliggjør organoiddannelse i reduserte konsentrasjoner av eksogent supplerte vekstfaktorer. Organoide kokultursystemer fra tarm- og leverepitel er beskrevet, men en protokoll for å etablere esophageal organoid-fibroblast co-kulturer er fortsatt fremragende 9,10,11.
I denne protokollen er to fluorescensaktiverte cellesorteringsstrategier (FACS) for fibroblaster fra spiserøret, ved bruk av enten transgene PdgfrαH2BeGFP-mus 12 eller villtypemus med klassisk antistofffarging skissert. Ulike subpopulasjoner av fibroblaster kan isoleres ved hjelp av celleoverflatemarkører etter eget valg, og gir dermed fleksibilitet til protokollen. I tillegg brukes en 3D-fluorescensavbildningsteknikk som bevarer organoid morfologi for å karakterisere fibroblast-organoid-interaksjoner. Organoid clearing gir en rask metode for å øke lyspenetrasjonsdybden i organoider, forbedre visualiseringen av organoid-fibroblastforbindelser og muliggjøre rekapitulering av organoidstrukturen i sin helhet. Denne protokollen kombinerer esophageal organoid co-kultur med en hel mount imaging strategi, som muliggjør funksjonell karakterisering av fibroblast-organoid interaksjon.
Protokollen som presenteres her etablerer en in vitro-modell for å undersøke funksjonelle esophageal epitel-fibroblastinteraksjoner.
Epitellaget er skilt fra stroma, noe som muliggjør en optimalisert dissosiasjonsprotokoll for både epitel- og stromalrommet. Til tross for optimalisering av epiteldissosiasjonsprotokollen, forblir vevsklumper tydelige. Pipettering opp og ned kraftig hvert 15. minutt reduserer antallet og størrelsen på klumper betydelig. Andre protokoller bruker trypsin for å dissosiere epitellaget 5,6 ytterligere. Her anbefales ikke bruk av trypsin, eller økning av dissosiasjonstiden ytterligere, da dette har en tendens til å resultere i redusert epitelcelle levedyktighet og organoidformingseffektivitet. I motsetning til epitelet blir stroma lett dissosiert, og 30 minutter i dissosiasjonsløsning resulterer i en enkeltcellesuspensjon med ~ 90% fibroblast levedyktighet (figur 1E). Ekskludering av epithelial-stomal separasjonstrinnet i protokollen øker dissosiasjonstiden betydelig, noe som resulterer i redusert fibroblastlevedyktighet og lavere utbytte av epitelceller. I tillegg gir separering av epitelet fra stroma en mulighet til å bestemme celletall for hver populasjon og blande epitelceller og fibroblaster fra forskjellige muselinjer når du setter opp samkulturer.
Studier av fibroblastfunksjon på organoid vekst er en vanlig brukt metode i stamcellebiologi 9,10,11,15,16. Etablerte samkulturmedier er enten DMEM supplert med 10% fosterkalveserum (FCS)9,15 eller vekstfaktorredusert medium10,16. I denne protokollen brukes vekstfaktorredusert medium til å etterligne forholdene i in vivo stamcellenisjen, hvor fibroblaster i stor grad er hvilende. FCS er et vekstfaktorrikt serum som resulterer i aktivering og proliferasjon av fibroblaster i kokulturer, sannsynligvis tilsvarende en fibroblastcelletilstand forskjellig fra in vivo-tilstanden. Ved å ekskludere FCS og redusere vekstfaktorer, slik at mediet alene (ERlavt) ikke støtter organoid vekst og ikke stimulerer fibroblastproliferasjon, er det mulig å isolere effekten av fibroblastene på organoidveksten. I dette mediet fjernes NOGGIN og RSPO reduseres til et minimum (10 % RPSO). Både NOGGIN og RSPO har vist seg å være essensielle for esophageal organoid vekst6. EGF ble beholdt i kokulturmediet, da det ikke støtter organoid vekst av seg selv. Imidlertid er fibroblaster også i stand til å støtte organoid vekst i et EGF-redusert medium (E lavRlav; Figur 2B,D).
Organoide kokulturer kan ikke opprettholdes gjennom passasjing da fibroblaster går tapt under trypsinisering. Imidlertid ble organoid passasje inkludert i protokollen siden esophageal organoider kan opprettholdes, utvides og brukes til videre eksperiment som monokulturer. Passasjerte organoider fra monokulturer kan brukes til å sette opp kokulturer med ferskt isolerte fibroblaster. En ulempe ved å bruke primære celler er antall mus som trengs for å sette opp flere organoide samkulturer. Ved fokus på små subpopulasjoner av fibroblaster er antall oppnådde kokulturer begrenset. I andre protokoller blir fibroblaster først utvidet i kultur før de brukes til å sette opp organoide kokulturer10. Imidlertid endrer fibroblaster morfologi og identitet under passasje, vist ved bruk av primære hud- og hjertefibroblaster17,18. Konvensjonell 2D-passering av esophageal fibroblaster resulterer i både morfologi og fenotypeendringer, noe som viser at in vitro-anrikning av fibroblaster ikke er egnet for kokulturer som tar sikte på fenokopiering av den endogene stamcellenisjen.
Hele mount farging gir et verktøy for å opprettholde og visualisere fibroblast-organoid interaksjon. Det skal bemerkes at selv om ikke alle organoider vil ha fibroblaster direkte festet til dem, er de fleste organoider i kontakt med fibroblaster (se figur 2C). For å opprettholde epithelial-fibroblast-interaksjoner er det viktig å håndtere organoider med forsiktighet og unngå kraftig pipettering, vortexing og høyhastighets spinning. Optimal fiksering er viktig for å opprettholde 3D-vevsarkitektur, samt holde endogen fluorescens. En 30 minutters fiksering er tilstrekkelig for å beholde H2BeGFP-signalet og er optimal for antistoffene som brukes i denne protokollen, men dette kan variere mellom fluoroforene og antistoffene som brukes. Rydding av organoidene reduserer lysspredning og forbedrer visualiseringen av hele 3D-strukturen betydelig. Siden organoidene er små, er rydding enkelt og raskt; Imidlertid kan avbildning av hele organoider ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi være tidkrevende, da flere Z-stabler må gjøres. Konfokale mikroskoper, som spinnskiven, kan brukes til å redusere bildetiden.
Samlet sett gir esophageal organoider dyrket i nærvær av fibroblaster et verdifullt verktøy for å forstå aspekter av esophageal stemcell nisje. I tillegg gir helmonteringsrydding en tilgjengelig metode for å visualisere samspillet mellom fibroblaster og organoider.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av ERC StG TroyCAN (851241). E.E. er en Cancerfonden Postdoctoral Associate. M.G. er Ragnar Söderberg Fellow og Cancerfonden Junior Investigator. Vi er takknemlige for den tekniske assistansen fra Karolinska Institutets kjernefasiliteter, inkludert Biomedicum Flow Cytometry Core Facility, Biomedicum Imaging Core (BIC) og Comparative Medicine Biomedicum (KMB) dyreavdeling. Vi takker medlemmer av Genander-laboratoriet for nøye å lese og kommentere protokollen.
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher (Gibco) | 17504001 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | fisher scientific | 356231 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher (Gibco) | 11320074 | |
DPBS | Thermo Fisher (Gibco) | 14190250 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher (Gibco) | 35050061 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 14175-129 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher (Gibco) | 15140122 | |
Triton X-100 solution | Merck | 93443-100ML | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 25200-056 | |
Chemicals, Peptides, and recombinant proteins | |||
DAPI Solution | Thermo Fisher | 62248 | |
Dissociation solution: 0.25 mg/ml Liberase TM, 0.25 mg/ml Dnase in HBSS | |||
Dnase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
Formaldehyde, 37%, with 10-15% methanol | Sigma-Aldrich | 252549-1L | |
Liberase | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
N-Acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
Noggin murine | Peprotech | 250-38 | |
RapiClear 1.47 | SunJin Lab | #RC147001 | |
Recombinant Mouse EGF Protein, CF | R&D systems | 2028-EG-200 | |
R-spondin-1 murine | Peprotech | 315-32 | |
SYTOX Blue Dead Cell Stain | Thermo Fisher | S34857 | |
Thermolysin | Sigma-Aldrich | T7902-25MG | |
Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503-5MG | |
Plastic & Glassware | |||
Corning Sterile Cell Strainers 40um | VWR | 15360801 | |
Corning Sterile Cell Strainers 70um | VWR | 431751 | |
Menzel Deckgläser/ cover slips | Thermo Fisher | Q10143263NR15 | |
SafeSeal reaction tube, 1.5 mL, PP | Sarstedt | 72.706 | |
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes 0.6 mL | Thermo Fisher | 3446 | |
SuperFrost Slides | VWR | 631-9483 | |
Tools | |||
0.05 mm 4 circular well iSpacer | SunJin Lab | #IS204 | |
Dumont #5 forceps, biology tip | F.S.T | 11252-20 | |
ImmEdge Pen | VectorLaboratories | H-4000 | |
Spring Scissors Angled to Side Ball Tip 8mm Cutting Edge | F.S.T | 15033-09 | |
Instruments | |||
Confocal microscope Stellaris 5 | Leica | ||
Dissection microscope ZEISS Stemi 305 | Zeiss | ||
FACS ARIA III | BD Biosciences | ||
Conjugated Antibodies for FACS | |||
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody Clone: 346-11A |
123608 | 123608 | |
APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Antibody | H194-112 | H194-112 | |
PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) Antibody | 147310 | 147310 | |
Antibodies for Immunofluorescence | |||
CD104 (ß-integrin 4) Clone: 346-11A |
BioLegend | 553745 | |
Cytokeratin 14 | Acris Antibodies (AbD Serotec) | BP5009 | |
Cytokeratin13 Clone: EPR3671 |
abcam | ab92551 | |
E-cadherin (CD324) Clone: 2.40E+11 |
Cell Signaling Technology | 3195 | |
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified Clone: Poly9059 |
BioLegend | 905901 | |
p63 Clone: 4a4 |
abcam | ab735 | |
Recombinant Anti-KLF4 antibod Clone: EPR20753-25 |
abcam | ab214666 | |
Vimentin | Sigma-Aldrich | AB5733 | |
Secondary antibodies | |||
Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice | Jackson Immuno |